基因工程工具酶

基因工程工具酶第1頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一基因工程的工具酶（instrumentalenzymeofgeneengineering）是應(yīng)用于基因工程的各種酶的總稱，包括核酸序列分析、標(biāo)記探針制備、載體構(gòu)建、目的基因選取重組體DNA制備等程序中所需要的酶類。第2頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一基因工程常用的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。第3頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)限制性內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）第4頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第5頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的脫氧核糖核酸酶。第6頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第7頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一1．限制與修飾系統(tǒng)上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)類似于人體的免疫系統(tǒng)，限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)菌排除異物保護(hù)自身的防御機(jī)制：限制——酶切外源DNA修飾——甲基化自身的內(nèi)切酶識別位點(diǎn)第8頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一

噬菌體在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)會受到限制。E.coli菌株λ噬菌體感染率KBCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的DNA。而C菌株不能限制來自K和B菌株的DNA。第9頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一2．限制酶的發(fā)現(xiàn)WernerArber于1962-1968年發(fā)現(xiàn)限制與修飾體系，1968年分離得到I型限制酶。1970年，H.Smith首次從流感嗜血桿菌（H.influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到HindⅡ限制酶。1971年，D.Nathans用HindII繪制了猿猴病毒SV40的限制酶譜。

第10頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一到1986年下半年，發(fā)現(xiàn)615種限制酶和98種甲基化酶。到2006年2月，共發(fā)現(xiàn)4583種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3773種，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有68、3692、10種。第11頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第12頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一限制酶的生物學(xué)功能是保護(hù)宿主不受外來DNA的感染，降解外來的DNA，從而阻止其復(fù)制和整合到細(xì)胞中。與限制酶伴生的修飾酶多是甲基轉(zhuǎn)移酶或甲基化酶，能保護(hù)自身的DNA不被降解。它們與對應(yīng)的限制酶識別相同的序列，但其作用不是切割DNA，而是在兩條鏈上對某個(gè)堿基進(jìn)行甲基化。限制酶與甲基轉(zhuǎn)移酶組成限制與修飾系統(tǒng)。第13頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一根據(jù)酶的亞單位組成、識別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)至少可分為三類。ⅡⅠⅢ酶分子內(nèi)切酶與甲基化酶

分子不在一起三亞基雙功能酶二亞基雙功能酶識別位點(diǎn)4-6bp,大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)二分非對稱5-7bp非對稱切割位點(diǎn)在識別位點(diǎn)中或靠近識別位點(diǎn)無特異性，至少在識別位點(diǎn)外1000bp在識別位點(diǎn)下游24-26bp限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)分開的反應(yīng)互斥同時(shí)競爭限制作用是否需用ATPNoYesYes第14頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一在三個(gè)限制與修飾系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。

Ⅱ型在限制與修飾系統(tǒng)所占的比例達(dá)到93%。它們識別回文對稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶3’-羥基和5’-磷酸基團(tuán)的DNA產(chǎn)物，需Mg2+的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。識別序列一般為4-6bp，切割位置因酶而異。第15頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第16頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一限制性內(nèi)切酶的命名由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。HindⅢ前三個(gè)字母來自于菌種名稱H.

influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個(gè)限制酶EcoRI—Escherichiacoli

RI

第17頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第18頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一

1.識別順序和酶切位點(diǎn)（1）限制酶識別序列的長度限制性內(nèi)切酶在雙鏈DNA上能夠識別的特殊核苷酸序列被稱為識別序列。識別序列的長度一般為4～8個(gè)堿基，最常見的為6個(gè)堿基。切割頻率理論上為1/4n（n為識別序列長度），實(shí)際上與序列有關(guān)。第19頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一（2）限制酶識別序列的結(jié)構(gòu)限制酶識別序列大多具有回文對稱結(jié)構(gòu)

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’有些限制酶的識別序列不對稱AccBSⅠCCG↓CTCGGC↑GAG第20頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一有些限制酶可識別多種序列有些限制酶識別的序列呈間斷對稱，對稱序列之間含有若干個(gè)任意堿基。

AlwNⅠCAGNNNCTGGTCNNNGAC

AccⅠGTMKACCAKMTG第21頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一（3）限制酶切割的位置限制酶對DNA的切割位置大多數(shù)在識別序列內(nèi)部，但也有在外部的。第22頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一2．末端種類（1）黏性末端（cohesiveend）識別位點(diǎn)為回文對稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為黏性末端，這樣形成的兩個(gè)末端是相同的，也是互補(bǔ)的。第23頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一第24頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一（2）平末端（Bluntend）在回文對稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端。如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）。第25頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一（3）非對稱突出端當(dāng)識別序列為非對稱序列時(shí)，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的。

BbvCⅠ

CCTCAGCGGAGTCGCCTCAGCGGAGTCG第26頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一（4）同裂酶（isoschizomer）識別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可能不同。同序同切同序異切同功多位識別序列有交叉第27頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一（5）同尾酶許多不同的限制酶切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的，且是對稱的，即它們可產(chǎn)生相同的黏性突出末端，這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割DNA得到的產(chǎn)物可進(jìn)行黏端連接。第28頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一3.DNA末端長度對限制酶切割的影響限制酶切割DNA時(shí)對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。第29頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一4.位點(diǎn)偏愛（Sitepreference）某些限制酶對不同位置的同一個(gè)識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。λ噬菌體DNA全長48,502bp，有5個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。切割時(shí)并非在5個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)進(jìn)行，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍。第30頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一造成位點(diǎn)偏愛現(xiàn)象的原因限制酶在切割DNA之前需要同時(shí)與兩個(gè)識別位點(diǎn)作用；限制酶對要求作用的DNA序列有兩個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)是為DNA切割時(shí)激活另一個(gè)的變構(gòu)位點(diǎn)。第31頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第32頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一對任意一個(gè)限制酶來說，都有其各自的最佳反應(yīng)條件。緩沖液反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間酶切反應(yīng)的終止第33頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第34頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。實(shí)際上星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)。第35頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一引起星星活性的因素甘油濃度高（>5%）限制酶過量（>100U/l）離子強(qiáng)度低（<25mM）pH值過高（>8.0）反應(yīng)體系含DMSO、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑Mg++

被其它二價(jià)陽離子如Mn++

、Cu++、Co++

或Zn++

代替第36頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一抑制星星活性的措施減少酶的用量（可避免過分酶切）減少甘油濃度保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇提高離子強(qiáng)度到100～150mM（但不能抑制酶活性）降低反應(yīng)pH至pH7.0保證使用Mg++作為二價(jià)陽離子第37頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第38頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一DNA重組限制酶（物理）圖譜繪制突變分析（RFLP分析）限制酶的部分酶切與完全酶切第39頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)

甲基化酶（Methylase）第40頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、甲基化酶的種類與識別序列二、甲基化對限制酶切的影響第41頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。1.

限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶三個(gè)系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。在DNA重組實(shí)驗(yàn)中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶作用位點(diǎn)可同可不同。M.EcoRI

GA

mATTCC

EcoRI

GAATTC

不同

M．HpaI

C

mCGG

HpaI

CCGG

相同第42頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一2.E.coli

的dam、dcm甲基化酶這類甲基化酶與限制酶無關(guān)，不構(gòu)成相應(yīng)的限制修飾系統(tǒng)。Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。GmATCDcm甲基化酶識別CCAGG或CCTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。C

mCAGGCmCTGG第43頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一該酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反應(yīng)與DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄等過程有關(guān)。3.哺乳動(dòng)物的甲基化酶第44頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一E.coli中至少有3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)

mcrA、mcrBC和mrr

，它們識別的序列各不相同，但只識別經(jīng)過甲基化的序列，都降解由CpG甲基化酶（MSssⅠ）作用的DNA。4.E.coli中依賴于甲基化的限制修飾系統(tǒng)第45頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、甲基化酶的種類與識別序列二、甲基化對限制酶切的影響第46頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一1．修飾酶切位點(diǎn)M.TaqⅠ處理DNA后，GTCGAC將不受HincⅡ切割。GTCGACGTCAACGTTGACGTTAACHincⅡM.TaqⅠ

TCGA第47頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一2．產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)DpnⅠ是依賴甲基化的限制酶，TCGATCGA

受M.TaqⅠ處理后形成甲基化（A）產(chǎn)物TCG*ATCG*A

，其中

G*ATC

即為DpnⅠ位點(diǎn)。第48頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)

DNA聚合酶（DNApolymerase）第49頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一DNA聚合酶指的是在DNA(或RNA)模板指導(dǎo)下，以4種dNTP為底物，在引物3’-OH末端聚合DNA鏈的一類酶。特點(diǎn)：①需模板(DNA或RNA)②需引物③聚合方向5′→3′④同時(shí)具有3′→5′和外切5′→3′外切作用第50頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一目前已開發(fā)的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli)Klenow片段(E.coli)T４DNA聚合酶T７DNA聚合酶TaqDNA聚合酶(耐熱)DNA末端轉(zhuǎn)移酶(小牛胸腺)反轉(zhuǎn)錄酶(依賴RNA)聚合酶依賴DNA的DNA聚合酶不依賴DNA的DNA聚合酶依賴RNA的DNA聚合酶第51頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一

一.E.coliDNA聚合酶I（polI）PolI參與DNA修復(fù)，具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII參與DNA修復(fù)，具3’→5’外切酶活性polIII參與DNA復(fù)制，具3’→5’和5’→3’外切酶活性

1.E.coli

的DNA聚合酶系統(tǒng)第52頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一

2.E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性5'--3'DNA聚合酶活性5'--3'外切核酸酶活性3’--5’外切酶活性交換反應(yīng)第53頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一3.E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途1）切口平移法制備探針Mg++DNaseⅠdNTPE.coliDNAPolⅠ第54頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一2）用于cDNA克隆中的第二鏈，即單純的DNA聚合活性。3）對3'突出端的DNA作末端標(biāo)記Mg++,DNAPolI

[α-32PdATP]

AT第55頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一二、KlenowDNA聚合酶KlenowDNA聚合酶是

E.coliDNApolⅠ經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5'--3'外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影響。也稱為Klenow片段，或E.coliDNA聚合酶Ⅰ大片段。第56頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一①補(bǔ)平3'凹端DNA。②抹平DNA3'凸端。③通過置換反應(yīng)對DNA進(jìn)行末端標(biāo)記。④在cDNA克隆中合成第二鏈。⑤隨機(jī)引物標(biāo)記。⑥應(yīng)用于雙脫氧鏈末端終止法DNA測序。⑦應(yīng)用于PCR反應(yīng)。⑧在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA。Klenow酶功能第57頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一三、T4噬菌體DNA聚合酶來源：T4噬菌體感染的E.coli結(jié)構(gòu)：MW=114000d活性：①5′→3′聚合反應(yīng)；

②3′→5′外切活性（活性比Klenow酶大200倍，且對單鏈DNA活性大于雙鏈DNA）第58頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一用途：①填補(bǔ)或標(biāo)記限制酶切后產(chǎn)生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端5′3′補(bǔ)齊或末端標(biāo)記，同于Klenow5′3′②3′-粘性末端的標(biāo)記制備DNA探針，同Klenow末端標(biāo)記③延伸結(jié)合于單鏈DNA模板上的誘變寡核苷酸引物。D誘變引物T4DNA聚合酶誘變DNA第59頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一四、T7噬菌體DNA聚合酶來源：T7噬菌體感染的E.coli結(jié)構(gòu)：由2個(gè)蛋白亞基組成：T7噬菌體基因5編碼的蛋白&宿主硫氧蛋白活性：①5′→3′聚合，在所有DNA聚合酶中持續(xù)反應(yīng)時(shí)間最長，所以合成的DNA鏈較長，在DNA測序中有很大優(yōu)越性；

②3′→5′外切活性（由T７噬菌體基因5編碼，是Klenow酶的1000倍。

）第60頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一用途：①復(fù)制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列5′3′3′5′③與T４DNApol一樣，平齊粘性末端。④定點(diǎn)突變中互補(bǔ)鏈的合成。②用填補(bǔ)或交換反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記。第61頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一測序酶（Sequenase）測序酶是美國UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌體DNA聚合酶，切除了99%以上的3'--5'外切活性。改進(jìn)的Sequenase2.0則切除了所有的3'--5'外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對長片段進(jìn)行測序的理想用酶。第62頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一五、TaqDNA聚合酶（耐熱）分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性。1.特點(diǎn)：第63頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一2.用途：①PCR反應(yīng)；②測序，高溫下進(jìn)行DNA合成可減少模板二級結(jié)構(gòu)。第64頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一六、DNA末端轉(zhuǎn)移酶分子克隆中常用的末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是存在于前淋巴細(xì)胞及分化早期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不依賴于模板的DNA聚合酶。在二價(jià)陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3’羥基端，形成同聚物末端。若dNTP為T或C，此二價(jià)陽離子首選Co2+

；若dNTP為A或G此二價(jià)陽離子首選Mg2+

。第65頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一①克隆DNA片段時(shí)加上互補(bǔ)同聚物末端，便于與載體連接。用途：②末端標(biāo)記第66頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一七、反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶即依賴于RNA的DNA聚合酶，它有5’--3’合成DNA活性，但是無3’--5’外切活性。它來自AMV（禽成髓細(xì)胞瘤病毒）或Mo-MLV（Moloney鼠白血病病毒，又稱M-MuLV）。第67頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一用途：①合成cDNA，克隆至載體中；②黏性末端補(bǔ)平、標(biāo)記；③雙脫氧測序時(shí)，如用其它酶效果不好，可使用反轉(zhuǎn)錄酶。第68頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)

其它分子克隆工具酶第69頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一一、依賴于DNA的RNA聚合酶來源：SP6噬菌體RNA聚合酶（來源于感染鼠傷寒沙門氏菌LT2菌株）；

T4或T7噬菌體RNA聚合酶（來源于噬菌體感染的大腸桿菌）。第70頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一

RNA聚合酶實(shí)際上就是轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識別DNA中各自特異的啟動(dòng)子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。無需引物，但需識別特異性位點(diǎn)。活性：①體外合成RNA分子。②用于表達(dá)外源基因。用途：第71頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一二、連接酶（Ligase）催化雙連DNA片段緊靠在一起的3’羥基和5’磷酸集團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。第72頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一1.T4DNA連接酶PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca++>0.1mM只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基特點(diǎn)用途1)相同或相容粘性末端的連接2)平整末端的相連抑制劑第73頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一只能連接具黏性末端DNA分子，以NAD作輔助因子2.E.coliDNA連接酶T4RNA連接酶可以催化單鏈DNA或RNA的5'-磷酸與另一單鏈DNA或RNA的3'羥基之間形成共價(jià)連接。3.T4RNA連接酶第74頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一三、T4多核苷酸激酶1.

催化反應(yīng)類型1)

激酶活性（5’-磷酸化酶）：可將ATP中的γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5’-羥基端2)3’-磷酸酶活性（pH5-6）1)5’-端末端標(biāo)記

2)分子克隆過程中以獲得5’-磷酸基末端，便于連接酶反應(yīng)2.

用途第75頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一四、堿性磷酸酶1)載體DNA的去磷酸化，防止自我連接，以增加重組頻率2)核酸末端標(biāo)記1.

特點(diǎn)1)除去ss-DNA，ds-DNA和RNA分子兩端的3’-和5’-磷酸基2)對熱穩(wěn)定2.

用途第76頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一五、核酸酶BAL31核酸酶來源于交替單胞菌（A.espejiana）BAL31，主要活性為3'外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3'端迅速去除單核苷酸，隨后可從單鏈DNA內(nèi)部發(fā)揮緩慢的內(nèi)切酶活性，形成截短了的平端雙鏈DNA分子（約占10-20%）以及帶有約5個(gè)核苷酸突出單鏈的截短分子（約占80-90%）。反應(yīng)依賴Ca++

，EDTA可抑制其活性。1．BAL31核酸酶第77頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一Sl核酸酶來源于米曲霉（A.oryzae），可降解單鏈DNA或RNA，是一種單鏈核酸酶。對dsDNA、dsRNA和DNA:RNA雜交體不敏感。用于分析DNA:RNA雜交體的結(jié)構(gòu)，去掉雙鏈核酸中突出的單鏈尾從而產(chǎn)生平末端，打開雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)。2．Sl核酸酶第78頁，共86頁，2023年，2月20日，星期一RNaseA來源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端?？沙NA:RNA中未雜交的RNA區(qū)，可用來確定DNA或RNA中單堿基突變的位置。廣泛用來去