基因工程與體外表達

基因工程與體外表達第1頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一重組DNA技術(shù)定義重組DNA技術(shù)是按照人們的意愿，在體外對DNA分子進行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細胞，使其在細胞中擴增、繁殖以獲得DNA分子的大量拷貝。所謂克隆是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。由于重組DNA技術(shù)實驗是對基因操作，故又稱為基因克隆或DNA克隆，同時由于這類克隆在分子水平上操作，又稱為分子克隆。第2頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一重組DNA技術(shù)的重大意義重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝；重組DNA技術(shù)縮短了進化時間；重組DNA技術(shù)使人能對生物進行定向改造。第3頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體克隆基因的表達及檢測純化第4頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一限制性核酸內(nèi)切酶

是一類能識別和切割DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶命名:以限制性內(nèi)切酶來源的微生物學(xué)名進行命名。通常第一字母（大、斜）代表該酶的微生物屬名；第二三字母（小、斜）代表微生物的種名；第四個字母代表寄主菌的株或型；第5頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一Ⅰ類：屬于復(fù)合功能酶，兼有修飾和切割DNA兩種功能，但識別、切割位點不一致；Ⅲ類：有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶功能，但在DNA鏈上特異切割點在識別位點以外；Ⅱ類：能識別切割雙鏈DNA特異序列，產(chǎn)生特異的DNA片段；限制性核酸內(nèi)切酶的分類第6頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一1、產(chǎn)生平末端：在識別順序的對稱軸上，對雙鏈DNA同時切割。Ⅱ類內(nèi)切酶切割形成端口類型HindⅡGTCGACCAGCTG第7頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一2、產(chǎn)生5`端突出的粘性末端：在識別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對稱軸的5`末端切割。BamHⅠGGATCCCCTAGG5`3`3`5`第8頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一3、產(chǎn)生3`端突出的粘性末端SacⅠGAGCTCCTCGAG5`3`3`5`第9頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一同功異源酶來源不同的限制酶，識別順序相同，切割位點可以相同也可以不同，這些酶稱同功異源酶。少數(shù)有特殊性質(zhì)的Ⅱ型酶GGATCCCCTAGGGGTACCCCATGG

BamHⅠGGATCCCCTAGGGGTACCCCATGGBstⅠKpnⅠAsp718Ⅰ第10頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一

有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA第11頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一

這種酶識別位點與切割位點不一致，但其切割與識別位點距離是一定的，一般為10個堿基。遠距離裂解酶可變酶

它們的識別序列中1個或幾個核苷酸是可變的。一般識別序列大于6個堿基第12頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一Ⅱ類限制性內(nèi)切酶操作注意事項1、防止污染，限制酶的量不應(yīng)超過總量的10%。2、整個操作過程在0℃進行，一般總是加完其他試劑后，最后加酶。3、酶應(yīng)分裝成小份存儲。4、當(dāng)DNA需要兩種以上的酶切時，最好是使用同種緩沖液。第13頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一(二)重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第14頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一基因克隆需要特定DNA載體

載體是攜帶靶DNA片段進入宿主細胞，進行擴增和表達的工具。其本質(zhì)是DNA。用于克隆和擴增特定的DNA片段的載體稱克隆載體，用于表達外源基因的稱為表達載體。載體應(yīng)具備以下特征：

1.至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。

2.

至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源DNA插入。

3.

至少應(yīng)有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞第15頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一1.質(zhì)粒

(plasmid)特點

能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。

質(zhì)粒是存在于細胞染色體外的小型雙鏈DNA分子,2-200Kb之間.本身含有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu),能在宿主細胞獨立自主進行復(fù)制,并在細胞分裂時,保持恒定地傳給子代細胞.缺點:該載體一般只能接受小于15kb的外源DNA片段.插入過大,會導(dǎo)致重組體擴增減慢,甚至插入片段先進丟失.第16頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一質(zhì)粒載體--pBR322

4.3kb多拷貝松弛型，內(nèi)含一個（Ori)、一個抗氨芐青霉素（Ampr）和一個抗四環(huán)素（Tetr）標記基因，在Ampr中有兩個內(nèi)切酶位點（PstI、PvuI)，在Tetr中有三個內(nèi)切酶位點（EcoRV、BamHI、SalI)。第17頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一目錄第18頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一PUC系列質(zhì)粒是由pBR322質(zhì)粒中的氨芐青抗性基因、復(fù)制起始點與大腸桿菌lacZ基因片段改建而成的.第19頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一1）抗性標記基因

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr

，Kanr，

b.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:抗除草劑基因2）營養(yǎng)標記基因

主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。標記基因的種類第20頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一3）生化標記基因

其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ。

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標記基因。第21頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一PLacZαLacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli

外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子第22頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一篩選重組子的示意圖第23頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一利用菌落顏色篩選重組子第24頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一

噬菌體是一類細菌病毒,有雙鏈噬菌體和單鏈噬菌體兩大類.前者為λ噬菌體類,后者包括M13噬菌體和f1噬菌體.λ噬菌體由于能夠攜帶外源DNA較大,而且感染能力也大于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌的能力,所以λ噬菌體一直被作為基因組文庫和cDNA文庫的克隆載體.M13噬菌體曾被廣泛用于制備單鏈DNA以進行DNA序列分析和體外定點突變.自從DNA測序列儀和PCR技術(shù)出現(xiàn),代替M13噬菌體在測序和定點突變中應(yīng)用.目前用于克隆和測序用的PUC載體就是利用質(zhì)粒和M13噬菌體改造成的.2.噬菌體(phage)載體第25頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一λ噬菌體載體

噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進入溶源狀態(tài)，也可進入裂解循環(huán)。噬菌體基因組為長度為48.5kb的雙鏈DNA分子，在噬菌體顆粒內(nèi)，基因組DNA呈線性，其兩端的5'末端帶有12個堿基的互補單鏈（粘性末端），12個堿基的序列為5'-GGGCGGCGACCT-3'。當(dāng)噬菌體DNA進入宿主細胞后，其兩端互補單鏈通過堿基配對形成環(huán)狀DNA分子，噬菌體可選擇進入裂解生長狀態(tài)或者進入溶源狀態(tài)。這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點第26頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體基因組全長48.5KB,至少可編碼60多個基因，它們的分布和排列與其功能有一定關(guān)系，根據(jù)執(zhí)行功能的不同可將基因組分為三個區(qū)。左邊區(qū)域:其產(chǎn)物用于噬菌體DNA的包裝和噬菌體顆粒的形成，中間區(qū)域:編碼基因調(diào)節(jié)、溶源狀態(tài)的發(fā)生和維持以及遺傳重組所需要的基因，其中許多基因?qū)α呀馍L是非必須的，在構(gòu)建載體時可以去掉，用外源DNA片段替代。中間區(qū)域占總基因組全長的40%.右邊區(qū)域:包含噬菌體復(fù)制和裂解宿主菌所必須的基因。第27頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一

這樣利用噬菌體基因組中大約40%非必需區(qū)域，從而插入外源DNA，成為置換型載體。插入DNA大小為9-23Kb,只有重組的噬菌體基因組DNA在野生型的75-105%之間,才能被包裝成噬菌體顆粒.

同時,如無外源DNA取代,由于噬菌體基因組太小,而不能包裝,這可以做了挑選重組噬菌體的陽性標志。第28頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一代表性λ噬菌體載體λgt10載體:可攜帶6KB的外源基因利用該載體攜帶有cⅠ基因，其表達的阻遏蛋白，可使噬菌體以溶源狀態(tài)生活，故形成混濁噬菌斑。同時載體攜帶的基因cⅠ內(nèi)的EcoRⅠ位點，可用于外源DNA片段的插入。重組后的λgt10變?yōu)閏Ⅰ-，cⅠ基因不表達，重組噬菌體可使大腸桿菌形成透明斑點。插入型載體：λgt10載體、λgt11載體置換型載體：EMBL3和EMBL4第29頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一λgt11載體：該載體最大的特點是在最左側(cè)可替代區(qū)置換了一段lacZ基因，可編碼b-半乳糖苷酶，在IPTG/X-gal平板上形成蘭色噬菌斑。同時lacZ基因編碼區(qū)終止密碼子之前有一個EcoRⅠ位點，可用于外源DNA片段的插入，篩選時，在lac-宿主菌中非重組噬菌斑為蘭色。當(dāng)外源DNA片段與lacZ的閱讀框相吻合時，可表達出融合蛋白，可用免疫學(xué)方法篩選陽性重組子。第30頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一置換型載體—可攜帶9-23KB外源基因第31頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一這兩個載體大小為43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分別為20kb、9kb和14kb。圖3-12是其結(jié)構(gòu)示意圖。從提高克隆效率角度來看，它們克隆DNA片段的大小為9-23kb。在填充片段中帶有

red和

gam基因，當(dāng)外源片段替換填充片段后，重組體將變成

red-gam-，同時載體上含有

chiC位點，因此可用P2噬菌體的溶源性大腸桿菌進行Spi篩選重組體。

第32頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一

野生型λ噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶源性E.coli中的生長會受到限制的表型，稱作Spi+，即對P2噬菌體的干擾敏感（sensitivetoP2interference）。如果λ噬菌體缺少兩個參與重組的基因red和gam，同時帶有chi位點，并且宿主菌為rec+，則可以在P2溶源性E.coli中生長良好，λ噬菌體的這種表型稱作Spi-。因此，通過λ噬菌體載體DNA上的red和/或gam基因的缺失或替換，可在P2噬菌體溶源性細菌中鑒別重組和非重組λ噬菌體。

Spi篩選

第33頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一粘性質(zhì)粒

是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。由入DNAcos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成.在宿主細胞中可以作為正常噬菌體進行復(fù)制，但不表達噬菌體的任何功能。cosmid的構(gòu)造特點:(1)含有抗藥標志和自主復(fù)制起始部位。(2)一個或多個單一酶的限制位點。(3)帶有入噬菌體粘性末端。這一末端是體外包裝系統(tǒng)必不可少的成分，所以它可以像入噬菌體一樣進行體外包裝。(4)分子小，約4—6kb，可容納大至40-50kb的外源DNA片段。適用于構(gòu)建真核細胞的基因文庫特。另外，由于非重組體cosmid很小，不能在體外包裝,因此非重組體的本底很低，利于重組克隆的篩選。第34頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一考斯質(zhì)粒的優(yōu)點

1)能象λ-DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細胞

2)可以裝載比質(zhì)?；颚?DNA大得多的外源DNA片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7kb，質(zhì)粒長為3.3kb，則該考斯質(zhì)粒最大可裝載46.5kb的外源DNA。

3)由于攜帶質(zhì)粒的選擇標記，便于篩選

4)由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。第35頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一M13噬菌體M13噬菌體的基因組為單鏈DNA，由6407的堿基組成。M13噬菌體感染細菌后，其基因組經(jīng)過復(fù)制轉(zhuǎn)變成雙鏈，稱為復(fù)制型，復(fù)制型M13在細胞內(nèi)拷貝數(shù)積累到100-200后，DNA合成變得不對稱，只有其中一條鏈進行復(fù)制，產(chǎn)生大量單鏈DNA，并被包裝成成熟的噬菌體顆粒，從細胞中排出。第36頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一

最為顯著的優(yōu)點是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈。用途：

（1）用于雙脫氧末端終止測定DNA順序

（2）用于單鏈DNA的定點誘變

（3）用于合成探針M13噬菌體作為載體的優(yōu)點及用途第37頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一整合型（integrated）載體：即外源基因通過這種病毒載體與宿主細胞的染色體整合，外源基因隨宿主細胞基因組的復(fù)制而擴增。這類載體的代表是SV40－PSV系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒－逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLPGHL、pMSV等。游離型(transient)或稱病毒顆粒型載體，這類載體攜帶外源基因后，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病毒顆的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進行復(fù)制。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。病毒載體第38頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一表達載體

指用來在受體細胞中表達外源基因的載體稱為表達載體。表達載體除具有克隆載體所具備的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。根據(jù)受體細胞不同，表達載體多種多樣，如原核表達載體、真核表達載體。第39頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一原核表達載體在原核表達載體中除含有復(fù)制起始點、抗性基因、多克隆位點等與克隆載體一樣之處外，還必需含有啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等表達元件。（一）、啟動子啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調(diào)控序列。第40頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATATATTA-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物保守序列RNA-pol辨認位點(recognitionsite)55RNA聚合酶保護區(qū)結(jié)構(gòu)基因33全酶第41頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一原核表達系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動子有Lac(乳糖啟動子)、Trp(色氨酸啟動子)、Tac(乳糖和色氨酸的雙啟動子)、λPL(λ

噬菌體的左向啟動子)、T7噬菌體啟動子等。第42頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一1、乳糖啟動子結(jié)構(gòu)示意圖

CAPCAMPIPOZYA結(jié)構(gòu)基因區(qū)（信息區(qū)）RNApol調(diào)控區(qū)調(diào)控區(qū)I-調(diào)節(jié)基因P-啟動子O-操縱基因（OP有一定的重疊）CAP結(jié)合位點結(jié)構(gòu)基因Z-β半乳糖苷酶基因（β-galactosidase）Y-半乳糖苷透酶（乳糖透酶）（β-galotosideporinerase）A-硫代半乳糖轉(zhuǎn)乙?；福╰ransacetylase）第43頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一

2、色氨酸啟動子第44頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一3、trp-lac啟動子（Tac啟動子）Tac啟動子是由trp啟動子加上Lac操縱子中的操縱元件、和SD序列融合而成。整個啟動子受Lac阻遏蛋白的負調(diào)節(jié)，它的啟動能力比Lac和trp都強。第45頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一4、λPL啟動子：lPL啟動子受控于溫度敏感的阻遏物cIts857。在低溫(30℃)時，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動子轉(zhuǎn)錄。在高溫(42℃)時，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動子轉(zhuǎn)錄。5、T7噬菌體啟動子它是來自T7噬菌體的啟動子，具有高度的特異性，只有T7RNA聚合酶才能使其啟動，其轉(zhuǎn)錄效率非常高。但要注意用這種啟動子時宿主中必須含有T7RNA聚合酶，如JM109。第46頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一（二）、SD序列-是外源基因在原核細胞翻譯必需的在mRNA起始AUG密碼上游約8到13核苷酸部位,存在一個4到9個核苷酸的一致序列:AGGAGG我們稱S-D序列,而在小亞基16S-rRNA3`端有一富含UCCUCC序列,通過與mRNA的S-D序列結(jié)合，使mRNA與小亞基結(jié)合.第47頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一（三）、轉(zhuǎn)錄終止序列—保證外源基因高效表達

在原核表達載體中，如果載體中沒有轉(zhuǎn)錄終止序列，也可以表達某基因的蛋白產(chǎn)物，但并非所有外源蛋白質(zhì)的表達都可獲得滿意效果，所以多數(shù)表達載體中都帶有轉(zhuǎn)錄終止序列。第48頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一真核表達載體—適合在真核細胞中表達外源基因如果將真核基因放入原核細胞中表達產(chǎn)生蛋白質(zhì)時，原核系統(tǒng)就表現(xiàn)出許多缺陷：①沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進行mRNA的剪接，所以只能表達cDNA而不能表達真核的基因組基因；②沒有真核翻譯后加工的功能，表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒有足夠的生物學(xué)活性；③表達的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會在細菌內(nèi)聚集成包涵體（inclusiionbody），尤其當(dāng)表達目的蛋白量超過細菌體總蛋白量10%時，就很容易形成包涵體。第49頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一

要表達真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達系統(tǒng)自然應(yīng)比原核系統(tǒng)優(yōu)越，常用的酵母、昆蟲、動物和哺乳類細胞等表達系統(tǒng)。真核表達載體至少要含兩類序列：①原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細菌中篩選克隆的抗藥性基因標志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。②在真核宿主細胞中表達重組基因所需要的元件，包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-A信號序列、mRNA剪接信號序列、能在宿主細胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細胞中篩選的標志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識別位點等。第50頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)DNA重組技術(shù)過程1、制備目的基因和相關(guān)載體2、將目的基因和有關(guān)載體進行連接3、將重組本DNA導(dǎo)入受體細胞4、DNA重組體的篩選和鑒定5、DNA重組體的擴增、表達和其他研究第51頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一目的基因序列的來源和分離一、基因組DNA文庫采用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成片段，每一片段都與一個載體分子拼接成重組體DNA，將所有重組體DNA分子都引入宿主細胞并進行擴增，得到分子克隆的混合體，這樣一個混合體稱為基因文庫。第52頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一二、cDNA文庫將某一時間某一種類細胞中所有的cDNA的混合體與載體進行連接，使每一個cDNA分子都與一個載體分子拼接成重組DNA，將所有重組DNA分子引入宿主細胞并進行擴增，得到分子克隆的混合體稱為cDNA文庫。第53頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一三、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（SanDiego，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（MCS）中。第54頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一四、人工化學(xué)合成第55頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一二、載體的選擇與制備λ噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫，pUC系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建cDNA文庫和克隆一些較小的DNA片段，M13噬菌體則用于克隆一些待測序的DNA片段。選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的基因是要表達的，則要選擇合適的表達載體。第56頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一三、重組體的連接1、粘性末端的連接2、利用人工接頭連接3、加入同聚物尾連接4、平端連接第57頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一四、將重組體DNA分子導(dǎo)入宿主細胞1、轉(zhuǎn)化指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。2、感染以λ噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)細胞，并在細胞內(nèi)擴增。第58頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一3、轉(zhuǎn)染指真核細胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)染方法：1、磷酸鈣共沉淀法2、電穿孔法3、DEAE-葡聚糖法4、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染5、顯微注射法第59頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一四、重組DNA導(dǎo)入細胞后的篩選與鑒定1、采用遺傳學(xué)方法篩選特定的重組DNA(1)

抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)第60頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄第61頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救目錄若克隆基因的表達產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補,那么就可以利用營養(yǎng)突變菌株進行篩選,這就是標志補救.第62頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一α互補的檢測目錄第63頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一2、免疫學(xué)方法利用特異性抗體檢測表達產(chǎn)物3、核酸雜交法篩選特定DNA第64頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一雞的β肌球蛋白的克隆和免疫學(xué)檢測方法目錄第65頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一原位雜交目錄第66頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一Southern印跡目錄第67頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一4、PCR技術(shù)對特定DNA進行直接鑒定5、利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定DNAhMLCK重組質(zhì)粒酶切圖譜分析1．未酶切質(zhì)粒

2.EcoRⅠ酶切

3.HindⅢ

酶切

4．EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切

5.250bpDNALadder第68頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一1、利用TK-細胞突變株進行篩選轉(zhuǎn)染細胞的抗性標記篩選TK-細胞TK+細胞HAT培養(yǎng)液不能存活能存活A(yù)：氨基蝶呤是核苷酸從頭合成的抑制物，H：次黃嘌呤可以作為補救合成dATP、dCTP的底物T：胸苷它必需在TK（胸苷激酶）作用下生成胸苷一磷酸。第69頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一2、藥物篩選：新霉素抗性基因G418是一種氨基糖苷類抗生素

,它的結(jié)構(gòu)和新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對原核和真核等細胞產(chǎn)生毒素

。當(dāng)neo基因（新霉素抗性基因）被整合進真核細胞DNA后

,

獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,使細胞獲得抗性而能在含有Ｇ418的選擇性培養(yǎng)基中生長。第70頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一第五節(jié)利用重組DNA技術(shù)可對基因進行改造基因定點誘變指將基因的某一個或某些位點進行人工替換或刪除的過程,稱為基因定點誘變.1、通過基因定點誘變可以改變蛋白質(zhì)編碼序列的個別密碼子，可以改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能；

2、通過改變具有調(diào)控功能的序列，可以確定DNA特定的功能區(qū)域；

3、構(gòu)建新的載體或嵌合基因。第71頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一一、帶突變位點的寡核苷酸可介導(dǎo)定點誘變第72頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一二、Kunkel法第73頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一三、PCR技術(shù)適合進行基因的定點誘變5`5`3`3`5`5`3`3`abcd5`3`3`5`變性、退火5`5`3`3`加klenowDNA聚合酶5`3`5`3`加入引物a、d5`3`5`3`3`5`3`第74頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一利用基因定點誘變可改變基因工程蛋白的特性

自然界的蛋白質(zhì)常具有一定的可塑性，當(dāng)某種蛋白質(zhì)中的一些氨基酸被改變或刪除后，其理化性質(zhì)發(fā)生了改變，但仍能保存其原有生物活性．同時一些蛋白質(zhì)相互融合后仍保持各自成分的活性．因此，通過基因突變而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的改變是可行的．

第75頁，共83頁，2023年，2月20日，星期一１、定點誘變可制備長效胰島素①將人胰島素Ｂ鏈２７位的Ｔｈｒ改為Ａｒｇ，②將Ｂ鏈羧基端氨基化和③Ａ鏈２１位Ａｓｎ改為Ｇｌｙ后，其胰島素的等電點從５．４移至６