葉綠體色素的提取分離定量及理化性質(zhì)的鑒定

雕RNR八舅一簞錢豪HtC類胡蘿卜素是體，其中B雕RNR八舅一簞錢豪HtC類胡蘿卜素是體，其中B異木分子毓著懈第一三簇番CH；—CH,a、B、Y三種異構(gòu)C—H葉綠體色素的提取、分離、定量及理化性質(zhì)的鑒定一、實驗原理葉綠體色素是植物吸收太陽光能進行光合作用的重要物質(zhì)，主要由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。它們與類囊體膜相結(jié)合成為色素蛋白復(fù)合體。葉綠體色素的結(jié)構(gòu)與分離崎向艮屁中?葉綠素a為藍(lán)黑色固體，在乙醇溶液中呈藍(lán)綠色；葉綠素b為暗綠色，其乙醇溶液呈黃綠色。Chla與Chlb是毗咯衍生物與鎂的絡(luò)合物，它們很相似，不同之處僅在于Chla第二個毗咯環(huán)上的一個甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。Chla與Chlb是植物進行光合作用必需的催化劑，易溶于石油醚等非極性溶劑中。通常植物中葉綠素a的含量是葉綠素b的三倍。其結(jié)構(gòu)式如下：崎向艮屁中?m—ch,wc種橙色的天然色素，屬于四萜，為一長B-胡蘿卜素(R=H)和葉黃素(R=OH)葉黃素是一種黃色色素，與葉綠素同存在于植物體內(nèi)，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶于乙醇，在石油醚中溶解度較小。秋天，’高等植物的葉綠素被破壞后，葉黃素的顏色就顯示出來。葉綠素與類胡蘿卜素都不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機溶劑提取。提取液可用色譜分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各種成分在兩相(固定相和流動相)間具有不同的分配系數(shù)，所以移動速度不同，經(jīng)過一定時間后，可將各種色素分開。葉綠體色素的物理性質(zhì)葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光亮度計精確測定。葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它從第一單線態(tài)返回基態(tài)時可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。因為分子吸收的光能有一部分消耗于分子內(nèi)部的振動上，發(fā)射的熒光的波長總是比被吸收光的波長要長。葉綠體色素的化學(xué)性質(zhì)葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。在酸性條件下，卟琳環(huán)中央的鎂離子可以被H+取代，產(chǎn)生褐色的去鎂葉綠素。葉綠素中的Mg2+也可以被其它金屬離子，如Cu2+或Zn2+等取代，此時葉綠素仍保持綠色。葉綠素是一種二羧酸——葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇(甲醇和葉綠醇)和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。根據(jù)朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律，某有色溶液的吸亮度A值與其中溶質(zhì)濃度C以及光徑L成正比，即A=aCL(a為該物質(zhì)的吸光系數(shù))。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光值可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸亮度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸亮度等于各組分在相應(yīng)波長下的吸亮度的總和，這就是吸亮度的加和性。今欲測定葉綠體色素提取液中葉綠素a、b含量，只需測定該提取液在2個特定波長下的吸亮度度值，并根據(jù)葉綠素a與b在該波長下的吸光系數(shù)即可求出各自的濃度。在測定葉綠素a、b含量時，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長應(yīng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：(1)A663=82.04Ca+9.27Cb(2)A645=16.75Ca+45.6Cb式中A663、A664分別為波長663nm和645nm處測定葉綠素溶液的吸亮度值；Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度(g/L)。解聯(lián)立方程(1)、(2)可得以下方程：(3)Ca=0.0127A663/CO269A645(4)Cb=0.0229A645-0.00468A663CHTOC\o"1-5"\h\z如此十綠素含量單位由g/L改為卵&，④、C④式則可改寫為：3+MC(5)Ca3mg/L)=12.7A66況&9|A645(6)Cb(mg/L)壘29A64號-468A6J8H92葉綠素總量(7)CT(mg/L)=CO3Cb=20.2A645+8.02A6632039葉綠素總量也可根據(jù)下式求導(dǎo)“8°、、、、./COOCHahsCHONH十CuACHONCu+2CHCOOHA652=3%0EC2323043J由于652nm為葉綠COO與Hb在紅光區(qū)吸收光譜曲線的交叉點(等吸收OOCH9有相同的比吸收系數(shù)(均為34.5)，因此也9可以在此波長下測定一次吸亮度(A652)求出葉綠素總量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652X1000/34.5(8)因此，可利用(5)、(6)式可分別計算葉綠素a與b含量，利用(7)式或(8)式可計算葉綠素總量。TOC\o"1-5"\h\z_、/?3/COok二、實驗?zāi)康摹?水如—CHON4Mg'+CHOH+CHOHCOOCH32304320391、掌握提取和分離葉綠體色3素的方法；COOK2、掌握測定葉綠體色素含量的方法；3、熟悉葉綠體色素的理化性質(zhì)及吸光特性；4、了解植物葉綠體色素組成及其與生境的相關(guān)性。三、實驗材料與儀器1、材料：菠菜葉和玉米葉。2、100%丙醇，80%丙醇，6"L1的鹽酸水溶液，30%K0H-甲醇溶液，乙醚，四氯

化碳，碳酸鈣粉末，醋酸銅晶體，石英砂。3、分析天平，研缽，漏斗，剪刀，點樣毛細(xì)管，層析缸，濾紙，試管，試管架，水浴鍋，移液槍。四、實驗步驟（一）葉綠體色素的提取、定量1、稱取新鮮菠菜葉片2.0g左右，放入研缽中，加5ml丙酮和少許碳酸鈣和石英砂，研磨成勻漿。2、再加入5ml丙酮，并攪拌均勻，用濾紙過濾，由于丙酮易揮發(fā)，最后定容至10ml。即為色素提取液，放于暗處備用。人搟葬皿小培養(yǎng)nr支亙||：：3、取0.1ml色素提取液，用80%丙酮稀釋到3ml，測定663、645nm處的吸光值，根據(jù)公式計算葉綠素a、葉綠素人搟葬皿小培養(yǎng)nr支亙||：：4、測定步驟3中的溶液在400nm到700nm之間的吸光值，每隔10nm測一次，制成菠菜葉綠體色素提取液的吸收光譜。5、稱取玉米葉片0.2g左右，重復(fù)上述步驟1-3，唯一不同的是我們?nèi)×?.3ml玉米色素提取液稀釋為3ml。（二）葉綠體色素的分離1、取圓形定性濾紙一張，用毛細(xì)管吸取葉綠體色素提取滴在圓形濾紙中心，使色素擴散的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，保證葉綠素擴展速度均勻，保證色素擴展清晰，風(fēng)干后，應(yīng)多點樣幾次，大約20次左右。2、在圓形濾紙中心戳一圓形小孔（直徑約3mm），將紙捻一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿突出）。培養(yǎng)皿中加入適量的四氯化碳，把帶有紙捻的圓形濾紙平放在培養(yǎng)皿上，使紙捻下端浸入推動劑中。迅速蓋好培養(yǎng)皿。此時，推動劑借毛細(xì)管引力順紙捻擴散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動，不久即可看到各種色素的同心圓環(huán)。所用培養(yǎng)皿底、蓋直徑應(yīng)相同，且應(yīng)略小于濾紙直徑，以便將濾紙架在培養(yǎng)皿邊緣上。3、長形濾紙一條，也點樣后層析分離。長形濾紙放入盛有四氯化碳大試管中，進行層析后獲得線形不同色素條帶，分別剪下后測定吸收光譜。（三）葉綠體色素的理化性質(zhì)1、葉綠素的熒光現(xiàn)象：取葉綠體色素提取液少許于1支試管中，用反射光和透射光觀察提取液的顏色有何不同，反射光下觀察到的提取液顏色即為葉綠素產(chǎn)生的熒光顏色。2、光對葉綠素的破壞作用：取葉綠體色素提取液少許，分裝兩支試管中，一支放在黑暗處（或用黑紙?zhí)装?，另一支放在強光下（陽光下），?jīng)過2-3h后，觀察兩支試管中溶液的顏色有何不同。3、銅代反應(yīng)：取上述色素提取液少許于試管中，一滴一滴加濃鹽酸，直至溶液顏色出現(xiàn)褐綠色，此時葉綠素分子已遭破壞，形成去鎂葉綠素。然后加醋酸銅晶體少許，慢慢加熱溶液，則又產(chǎn)生鮮亮的綠色。此即形成了銅代葉綠素。4、皂化反應(yīng)：取葉綠體色素提取液2mL于大試管中，加入4mL乙醚，搖勻，再沿試管壁慢慢加人3mL蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻，溶液即分為兩層，色素已全部轉(zhuǎn)入上層乙醚中。用滴管吸取上層綠色層溶液，放入另一試管中，再用蒸餾水沖洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30%KOH一甲醇溶液，充分搖勻，再加入蒸餾水約3-5mL，搖勻靜置。

五、結(jié)果葉綠素含量及對比0菠菜葉綠體色素的吸收光譜046OL6.080050QZ5.0^4.06表一菠菜與玉米葉綠素的含量及對比0菠菜葉綠體色素的吸收光譜046OL6.080050QZ5.0^4.06項目菠菜葉玉米葉稱取量/g2.00900.2090稀釋倍數(shù)3010OD6450.1630.053OD6630.4050.173Ca=12.7OD663-2.69OD645(ug/ml)4.7052.055Cb=22.9OD645-4.68OD663(ug/ml)1.8370.404Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663(ug/ml)6.5412.458Chla含量(ug/g)702.588983.254Chlb含量(ug/g)224.316233.301ChlT含量(ug/g)976.6551176.077光合作用時CO2中的C直接轉(zhuǎn)移到C3（3-磷酸甘油酸）里的植物叫做C3植物，菠菜為C3植物；光合作用時CO2中的C首先轉(zhuǎn)移到C4（草酰乙酸）里，然后再轉(zhuǎn)移到C3中的植物叫做C4植物，玉米為C4植物。兩類植物在葉綠體的結(jié)構(gòu)及分布上不同，C3植物的維管束不含葉綠體，葉脈顏色較淺；C4植物的維管束含葉綠體，葉脈綠色較深有呈“花環(huán)型”的兩圈細(xì)胞。C4植物葉肉細(xì)胞的葉綠體固定CO2的酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC與CO2的親和力強于C3植物葉綠體內(nèi)固定CO2的酶。C4植物將CO2泵入維管束鞘細(xì)胞，改變了CO2/O2比率，改變了Rubisico（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶）的作用方向，降低了光呼吸。故C4植物比C3植物具有更強的光合作用。從表一中可以看出，玉米的葉綠素a和葉綠素b含量都比菠菜的葉綠素a和葉綠素b含量都要高，玉米葉片中葉綠素總含量為1176.077ug/g，a/b值為4.6；菠菜葉片的葉綠素總含量比玉米低，只有976.655ug/g，a/b值為2.9，也比玉米低，但葉綠素b含量與玉米相近。由此可見，葉綠素含量的高低及其a/b比值的大小在一定程度上也影響光合速率的大小。玉米葉片的葉綠素含量較高，其單位葉面積的葉綠素數(shù)目最多，因而光合速率大，這可能是導(dǎo)致玉米光合速率較高的因素之一。葉綠體色素的分離及其吸收光譜1）圓形濾紙層析分析在濾紙上可清楚地看到藍(lán)綠色的葉綠素a，黃綠色的葉綠素b，黃色的葉黃素和橙黃色的胡蘿卜素，但葉黃素和胡蘿卜素長時間放置后無法看清。葉綠素a第二個毗咯環(huán)上的一個甲基

(-CH3)被醛基(-CHO)所取代后為葉綠素b；類胡蘿卜素屬于四萜，為一長鏈被軛多烯M胡蘿卜素的兩個-H被-OH取代后為葉黃素。葉綠體色素的極性按從大到小綠素b＞葉綠素a＞葉黃素＞胡蘿卜素根據(jù)相似相溶原理，在有機溶液中的溶葉綠素a＜葉黃素＜胡蘿卜素，故極性越大，在展開劑中移動的速度越慢，所以濾紙上從外到內(nèi)的四個色素帶圈分別排列分別是：葉解度：葉綠素^凋卦素0.80.6值0.40.2葉黃素、葉綠I,菠菜葉綠體色素的吸收光譜素!、葉綠素"■ArnKir^i蘿卜素黃素綠素aMbnm由上圖可以看出，菠菜葉片中葉綠體色素含量從高到低依次為葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、胡蘿卜素。并且可以看到葉綠素a分別在大約430nm和663nm處具有兩個吸收峰，它在紅光區(qū)的吸收帶偏向長波方面，吸收帶較寬，吸收峰交高，而在藍(lán)紫光區(qū)的吸收帶偏向短光波方面，吸收峰較窄，吸收峰較低；而葉綠素b的吸收峰位于460nm和650nm附近。理論上，葉綠素a在紅光區(qū)的吸收峰比葉綠素b的高，藍(lán)紫光區(qū)的吸收峰咋比葉綠素b的低，但從上圖看，葉綠素a在藍(lán)紫光區(qū)的吸收峰咋比葉綠素(-CH3)被醛基(-CHO)所取代后為葉綠素b；類胡蘿卜素屬于四萜，為一長鏈被軛多烯M胡蘿卜素的兩個-H被-OH取代后為葉黃素。葉綠體色素的極性按從大到小綠素b＞葉綠素a＞葉黃素＞胡蘿卜素根據(jù)相似相溶原理，在有機溶液中的溶葉綠素a＜葉黃素＜胡蘿卜素，故極性越大，在展開劑中移動的速度越慢，所以濾紙上從外到內(nèi)的四個色素帶圈分別排列分別是：葉解度：葉綠素^凋卦素0.80.6值0.40.2葉黃素、葉綠I,菠菜葉綠體色素的吸收光譜素!、葉綠素"■ArnKir^i蘿卜素黃素綠素aMb葉綠體色素理化性質(zhì)實驗現(xiàn)象及分析1)熒光反應(yīng)：現(xiàn)象：用透射光觀察色素提取液為綠色，用反射光觀察則為深紅色(葉綠素a為血紅光，葉綠素b為棕紅光)透射光下分析：葉綠素吸收光譜的最強吸收區(qū)是波長640-660nm左右的紅光區(qū)和430-450nm左右的光下藍(lán)紫光區(qū)，葉綠素對橙光、黃光吸收較少，尤其對綠光吸收最少，所以用透射光觀察色素提取液時看到綠色；產(chǎn)生紅色反射光是因為熒光現(xiàn)象，它產(chǎn)生的原因如下：光具有波粒二象性，

對光合作用有效的可見光的波長是在400—700nm之間，同時光又是一粒一粒地運動著的粒子流，每一粒子叫一個光子，光子所具有的能量，叫做光量子。光子攜帶的能量與光的波長成反比。每摩爾光量子具有的能量如下：E=Nhu=Nhc/入式中E為能量（千卡），N為阿伏加德羅常數(shù)（6.02X1023），h為普朗克常數(shù)（6.6262X10-34JS），u為頻率（s-1），c是光速（2.9979X108ms-1），（2.9979X108ms-1），入是波長（示。當(dāng)葉綠素分子吸收光量爾（Bohr）理論，）。每摩爾光量子的能量通常是以千卡或愛因斯坦來表一個高能級的激發(fā)態(tài)。根據(jù)波低能軌道躍到遠(yuǎn)核高能軌道上為激發(fā)態(tài)（第一、二單線態(tài)），nm，就由低能級的基態(tài)提定激發(fā)態(tài)的葉綠體分子極不穩(wěn)定，又迅速由激發(fā)態(tài)恢復(fù)到基態(tài)，同時向空間發(fā)射光子，稱為熒光。恒溫下，熒光的光子要比吸收的光子能量低，所以放出的波長更長、顏色更紅些，因而使葉綠素溶液在入射光下呈綠色，而在反射光下呈紅色。葉綠素的熒光現(xiàn)象說明葉綠素能被光所激發(fā)，而葉綠素分子的激發(fā)是其能將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的前提。在整體植物中，葉綠素所吸收的光能被用于光合作用，因此看不到熒光現(xiàn)象。當(dāng)熒光出現(xiàn)后，立即中斷光源，色素分子仍能持續(xù)短時間的放出“余輝”，稱磷光現(xiàn)象。這種現(xiàn)象的原因是處于第一單線態(tài)的激發(fā)態(tài)的葉綠素分子，先以熱能的形式丟失掉一部能量，轉(zhuǎn)為一種亞穩(wěn)定態(tài)（第一三線態(tài)），從亞穩(wěn)定態(tài)回到基態(tài)時放出的光子便為磷光，其壽命比熒光長（熒光為10-9s，磷光為10-3—10-2s），但比熒光弱。2）光破壞：現(xiàn)象：培養(yǎng)箱中光照2h后色素提取液呈黃褐色，而暗室中提取液仍為綠色。分析：參考中科院植物研究所的《光逆境對葉綠體葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合物的影響》知，強光照射對菠菜葉綠體的葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合物會產(chǎn)生一些光合特性的影響。實驗結(jié)果表明，隨著強光照射時間的延長，首先，屬光系統(tǒng)11核心的葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合物的CPa帶明顯減少了，進而屬LHCII的寡聚體和二聚體的帶有了不同程度的降低，最后，包括光系統(tǒng)I在內(nèi)的葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合物帶大部分被分解了。結(jié)果還表明，當(dāng)光逆境還未使葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合物發(fā)生明顯變化時，代表光系統(tǒng)II活性的Fv/Fo值及DCIP光還原活性就已顯著地降低了。強光照射對菠菜葉綠體中葉綠素含量及chla/b也有一定影響，菠菜葉綠體隨著強光照射時間的延長，葉綠素含量明顯下降，照光7小時的葉綠體，其葉綠素含量下降高達一半，且chla比chlb更易被破壞。強光照射首先使光系統(tǒng)I反應(yīng)中心受到損傷，其活性大大降低；葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合物的減少主要是由于進一步的光氧化造成的，因為葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，植物體內(nèi)本來有還原酶，可以破壞光產(chǎn)生的強氧化物質(zhì)。而葉綠素離體后，無法被分解的強氧化物質(zhì)會破壞不穩(wěn)定的葉綠素，它的吸亮度在663nm（綠光）下會變大的，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定，故強光照射后提取液呈黃褐色。3）銅代反應(yīng)：現(xiàn)象：滴加濃鹽酸后溶液呈黃褐色，加入醋酸銅晶體并水浴加熱后溶液變綠加入濃鹽酸加入濃鹽酸ooche分析：加入濃鹽酸后，葉綠素卟琳環(huán)中心的Mg離子被氫離子取代，生成褐綠色的去鎂葉綠素；再向溶液中加入醋酸銅晶體并水浴加熱后，銅離子取代卟琳環(huán)中心的氫離子而生成綠色的銅代葉綠素，它穩(wěn)定而不易降解，故常用醋酸銅處理來保存綠色植物標(biāo)本T.IJULnriHs^i4）皂化反應(yīng)：g口式現(xiàn)象：加30%KOH-甲醇后溶液變深褐玲外。。恥吊吝/+匚沔。代十匚覽H町DH色，加水搖動后，溶液分為兩層，ooche水中溶有葉綠酸的鹽，呈綠色。分析：分層后的溶液上層為乙醚層，下層為水層。葉綠酸是二羧酸，其中一個羧基被甲醇酯化，另一個被葉綠醇酯化。葉綠素是葉綠酸的酯，能發(fā)生皂化反應(yīng)。葉綠素的鹽形成以后，因分子極性增大，易溶于水中，不能進入乙醚層；而類胡蘿卜素在乙醚層中的溶解度大于在水中的溶解度，故上層的乙醚層中含未發(fā)生反應(yīng)的易溶于有機溶劑的葉黃素和胡蘿卜素，呈黃色；下層的-—"六、注意事項1.提取本實驗色素存在于綠色植物葉肉細(xì)胞的葉綠體中，且具有脂溶性。因此，選擇的材料應(yīng)是葉肉細(xì)胞（幼嫩、色濃綠的葉片）。為了避免葉綠素的光分解，操作時應(yīng)在弱光下進行：水中溶有葉綠酸的鹽，呈綠色。剪：葉片要新鮮、顏色要深綠，越細(xì)越好，盡量去除葉脈等部分。加藥品：二氧化硅、碳酸鈣和丙酮。二氧化