流式細胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用講義演示文稿

流式細胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用講義演示文稿目前一頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點流式細胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用講義目前二頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點第一節(jié)概述一、工作原理二、散射光的測定三、熒光測量四、細胞分選原理第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析一、參數(shù)二、數(shù)據(jù)顯示方式三、設(shè)門分析技術(shù)第三節(jié)流式細胞儀免疫分析的技術(shù)要求一、免疫檢測樣品制備二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色三、免疫膠乳顆粒的應(yīng)用四、流式細胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制目前三頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點第四節(jié)流式細胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中的應(yīng)用一、淋巴細胞及其亞群的分析二、淋巴細胞功能分析三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型四、腫瘤耐藥相關(guān)蛋白分析五、AIDS病檢測中的應(yīng)用六、自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析七、移植免疫中的應(yīng)用思考題小結(jié)目前四頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。目前五頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點流式細胞術(shù)最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。細胞不被破壞，測量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量流式細胞術(shù)的特點目前六頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點

流式細胞儀是測量染色細胞標(biāo)記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術(shù)。第一節(jié)概述目前七頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點目前八頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點細胞組成細胞功能大小細胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性目前九頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。一、工作原理目前十頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點（1）液流系統(tǒng)（2）光學(xué)系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)：目前十一頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統(tǒng)目前十二頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點噴嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系統(tǒng)示意圖目前十三頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管目前十四頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)目前十五頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學(xué)系統(tǒng)示意圖目前十六頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點主要由計算機及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)目前十七頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點基本工作原理目前十八頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點單細胞液柱已標(biāo)記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過程目前十九頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點區(qū)別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學(xué)信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計計算機，>5000人工，200結(jié)果多參數(shù)，綜合分析簡單，單參數(shù)流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別目前二十頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光的測定目前二十一頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點目前二十二頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。目前二十三頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點FALSSensorLaser前向散射光示意圖目前二十四頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。目前二十五頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光示意圖目前二十六頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

目前二十七頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點熒光信號由被檢細胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數(shù)放大器三、熒光測量目前二十八頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)目前二十九頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點目前三十頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點熒光補償目前三十一頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。四、細胞分選原理目前三十二頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電（一）分選基本原理目前三十三頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點分選速度：單位時間內(nèi)分選的細胞數(shù)量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設(shè)定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。（二）分選的技術(shù)要求目前三十四頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點圖）設(shè)門分析技術(shù)第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析目前三十五頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)目前三十六頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式目前三十七頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖目前三十八頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點單參數(shù)直方圖細胞相對數(shù)量信道(channel)目前三十九頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖目前四十頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點1.雙參數(shù)直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度目前四十一頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點雙參數(shù)直方圖點圖目前四十二頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細胞數(shù)變化率越大。目前四十三頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點二維等高圖目前四十四頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點3.假三維等高圖目前四十五頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點（三）三參數(shù)直方圖目前四十六頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點多參數(shù)分析：當(dāng)細胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析目前四十七頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設(shè)門分析技術(shù)目前四十八頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門目前四十九頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點線性門目前五十頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點Region設(shè)置:

區(qū)閾（region,R）與門(gate,G)是兩個相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對應(yīng)，但是也可以包含于門。目前五十一頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。

目前五十二頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點樣本制備標(biāo)記染色液相芯片技術(shù)質(zhì)量控制第四節(jié)流式細胞儀免疫分析的技術(shù)要求

目前五十三頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點外周血淋巴細胞樣品的制備 分離單個核細胞培養(yǎng)細胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落 洗滌尼龍網(wǎng)過濾單細胞懸液一、免疫檢測樣品制備目前五十四頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）目前五十五頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點適用條件:有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色目前五十六頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料目前五十七頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料目前五十八頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復(fù)合染料目前五十九頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機制目前六十頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點熒光染料與細胞成分的四種結(jié)合方式

結(jié)構(gòu)親和式 嵌入結(jié)合 共價鍵結(jié)合 熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法

直標(biāo):干擾少,但需購買多種單抗 間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體 組合標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記目前六十一頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標(biāo)本，在懸液中與微粒進行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測特產(chǎn)生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用目前六十二頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）目前六十三頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點目前六十四頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點通過對標(biāo)記不同熒光素分子的檢測，實現(xiàn)FCM對可溶性物質(zhì)的定量分析目前六十五頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚砑t細胞實體組織來源標(biāo)本用機械法溫度25~37℃，pH7.0~7.2四、流式細胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制（一）單細胞懸液制備的質(zhì)控目前六十六頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點溫度pH染料濃度固定劑（二）免疫熒光染色的質(zhì)控目前六十七頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準(zhǔn):保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對計數(shù)校準(zhǔn):保證計數(shù)的準(zhǔn)確性。Flow-checkFlow-setFlow-count（三）儀器操作的質(zhì)控目前六十八頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點同型對照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：與待測標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測，結(jié)果達靶值，提示本次實驗結(jié)果可靠。（四）免疫檢測的質(zhì)控目前六十九頁\總數(shù)七十五頁\編于十五點流式細胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和逐步進入臨床應(yīng)用各方面，用流式細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標(biāo)記分析，可區(qū)別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有