基因測序資料

第一章緒論-基因（Gene）：又叫遺傳因子，是控制生物性狀的基本遺傳單位，本質(zhì)上是攜帶著遺傳信息的DNA/RNA片段。-基因組（Genomic）:是指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA/RNA分子?；虻念愋停?結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因-斷裂基因-假基因-移動基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因：能為多肽鏈編碼的基因稱為結(jié)構(gòu)基因，包括編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白的基因，也包括編碼阻遏蛋白或激活蛋白的調(diào)節(jié)基因。有些基因只能轉(zhuǎn)錄而不能翻譯，如tRNA基因和rRNA基因。還有些DNA區(qū)段，其本身并不進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，但對其鄰近的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起控制作用，被稱為啟動基因和操縱基因。啟動基因、操縱基因與其控制下的一系列結(jié)構(gòu)基因組成一個功能單位叫做操縱子（operon）。就其功能而言，調(diào)節(jié)基因、操縱基因和啟動基因都屬于調(diào)控基因。這些基因的發(fā)現(xiàn)，大大拓寬了人們對基因功能及相互關(guān)系的認(rèn)識。斷裂基因20世紀(jì)70年代中期，法國生物化學(xué)家發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)基因并非全部由編碼序列組成，而是在編碼序列中間插入無編碼作用的堿基序列，這類基因被稱為間隔或斷裂基因。重疊基因1977年，首先發(fā)現(xiàn)了基因的重疊現(xiàn)象。1978年，費爾（Feir）和桑戈爾（Sangor）在研究分析9X174噬菌體的核苷酸序列時，也發(fā)現(xiàn)由5375個核苷酸組成的單鏈DNA所包含的10個基因中有幾個基因具有不同程度的重疊，但是這些重疊的基因具有不同的讀碼框架?；虻闹丿B性使有限的DNA序列包含了更多的遺傳信息，是生物對它的遺傳物質(zhì)經(jīng)濟(jì)而合理的利用。假基因1977年，在對非洲爪贍5SrRNA基因簇的研究后提出了假基因的概念，這是一種核苷酸序列同其相應(yīng)的正常功能基因基本相同，但卻不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因。由于假基因不工作或無效工作，故有人認(rèn)為假基因，相當(dāng)人的痕跡器官，或作為后補(bǔ)基因。移動基因1950年，美國遺傳學(xué)家麥克林托卡在玉米染色體組中首先發(fā)現(xiàn)移動基因。她發(fā)現(xiàn)玉米染色體上有一種稱為Ds的控制基因會改變位置，同時引起染色體斷裂，使其離開或插入部位鄰近的基因失活或恢復(fù)恬性，從而導(dǎo)致玉米籽粒性狀改變。移動基因不僅能在個體的染色體組內(nèi)移動，并能在個體間甚至種間移動?，F(xiàn)已了解到真核細(xì)胞中普遍存在移動基因?；蛞苿有缘陌l(fā)現(xiàn)不僅打破了遺傳的DNA恒定論，而且對于認(rèn)識腫瘤基因的形成和表達(dá)，以及生物演化中信息量的擴(kuò)大等研究工作也將提供新的啟示和線索。DNA測序技術(shù)的起源-1975年，Sanger發(fā)明的DNA測序加減法為實現(xiàn)這一企圖起了關(guān)鍵性的作用。-1977年，Maxam和Gilbert發(fā)明了化學(xué)降解法——由此而發(fā)展起來的大片段DNA順序快速測定技術(shù)。-1977年，Sanger發(fā)明了末端脫氧終止法，已是核酸結(jié)構(gòu)與功能研究中不可缺少的分析手段。焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術(shù)概念：Pyrosequencing技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。試劑：DNA聚合酶(DNApolymerase)ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)熒光素酶(luciferase)三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)adenosine5'phosphosulfate(APS)、熒光素(luciferin)基本原理：第1步：1個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)o第2步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)o第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。氧化熒光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機(jī)檢測并由軟件pyrogram^反應(yīng)為峰。每個光信號的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第4步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。第5步：加入另一種dNTP，使第2—4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。?優(yōu)點：不需要制膠，不需要毛細(xì)管，也不需要熒光染料和同位素染色。?10分鐘內(nèi)可分析96個樣品的SNP，可滿足高通量分析的要求。?可進(jìn)行獨立的測序或SNP分析，實驗設(shè)計靈活。?序列分析簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。利用PSQ96系統(tǒng)進(jìn)行測序分析可期望得到20-30個堿基的讀序長度，但是和任何測序技術(shù)一樣，最大讀序長度取決于：>模板的二級結(jié)構(gòu)、堿基組成PCR產(chǎn)物質(zhì)量其他參數(shù)應(yīng)用：焦磷酸測序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適于對已知的短序列的測序分析，其可重復(fù)性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。焦磷酸測序技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，具備同時對大量樣品進(jìn)行測序分析的能力。在單核苷酸多態(tài)性、病原微生物快速鑒定、病因?qū)W和法醫(yī)鑒定研究等方面有著越來越廣泛的應(yīng)用。第三章基因測序中的主要技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)原理：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是以待擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，在體外按照半保留復(fù)制的方式沿著模板鏈延伸直到合成新的DNA鏈的技術(shù)。變性：指雙鏈DNA在化學(xué)或物理因素作用下，解旋成單鏈DNA的過程。退火：指在適當(dāng)?shù)臈l件下，互補(bǔ)的單鏈DNA重新螺旋成雙鏈DNA的過程。延伸：寡核苷酸引物在熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化下，由5?-末端向3'-末端合成新DNA鏈的過程?；痉从吵绦颍悍磻?yīng)溫度反應(yīng)時間TOC\o"1-5"\h\z94°C10min94C45sec56C45sec72C1mingoto2（30cycles）\o"CurrentDocument"72C10min4Cforever特點：特異性強(qiáng)靈敏度高簡便快速對靶DNA的純度要求低瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為（PAGE）,是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下，聚合而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶。特點：?分辨率高?載樣量大?回收的DNA純度高?凝膠無色透明，紫外線吸收低?抗腐蝕性強(qiáng)、機(jī)械強(qiáng)度高、韌性變性聚丙烯酰胺凝膠凝膠中加入尿素作為變性劑，確保DNA保持單鏈結(jié)構(gòu)并以線性分子形式泳動含甲酰胺的聚丙烯酰胺凝膠測序膠中加入甲酰胺以減少DNA二級結(jié)構(gòu)的形成步驟：第四章基因測序技術(shù)§1.雙脫氧鏈終止法反應(yīng)體系：DNA模板引物1（帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸）引物2（帶有3?-OH末端的單鏈寡核苷酸）DNA聚合酶dNTPs（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）ddNTP基本原理：在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTPs中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸既偶然又十分特異的發(fā)生終止，產(chǎn)物是一系列具有相同的5'-引物端和以ddNTP殘基為3端結(jié)尾的寡核苷酸鏈。在4組獨立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。最后將四種產(chǎn)物同時進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所得的放射自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的DNA鏈中的堿基A、T、C、G準(zhǔn)定準(zhǔn)確位置。測序酶：-大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)測序酶(sequenase)耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)DNA序列的識讀是一個熟能生巧的過程。注意幾點技巧：①在顯影前后一定要注意標(biāo)明模板名稱、日期和測序人等，并標(biāo)明各套反應(yīng)位置；②識讀時從顯而易見的特征序列開始，如連續(xù)的同聚核苷酸(如TTTTT、AAAAA)或交替出現(xiàn)的嘌吟和嘧啶(如GTGTGTGT)，一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置?！?.熒光標(biāo)記雙脫氧測序法雙脫氧鏈終止法的優(yōu)點：適用于許多種不同類型的DNA模板雙脫氧終止法使用的DNA模板從重組M13噬菌體中分離的單鏈DNA熱或堿變性的質(zhì)粒/PCR擴(kuò)增雙鏈DNA用外切酶消化雙鏈DNA產(chǎn)生的單鏈DNA通過不對稱PCR獲得的單鏈DNA循環(huán)測序中熱變性的雙鏈DNA可以采取多種不同的測序策略利用PCR的循環(huán)測序用M13噬菌體構(gòu)建文庫，進(jìn)行鳥槍測序采用不同的DNA聚合酶進(jìn)行測序測序長度具有潛在力第二節(jié)化學(xué)降解法基本原理：一個末端標(biāo)記的DNA片段在幾組互相獨立的的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某一種或某一類堿基。因此生成一系列放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(放射性標(biāo)記末端)延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標(biāo)記的分子?；瘜W(xué)降解法測序制備DNA片段的核素標(biāo)記有三種方法：利用T4噬菌體多核苷酸激酶和Y-32P-ATP標(biāo)記DNA的5'-末端利用末端轉(zhuǎn)移酶和a-32P-ddNTP標(biāo)記DNA的3'-末端利用Klenow片段和a-32P-dNTP對限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的3'-凹進(jìn)末端進(jìn)行標(biāo)記對于測序電泳圖譜的識讀，化學(xué)降解法測序要比末端終止法較為復(fù)雜，因為化學(xué)裂解反應(yīng)并非是完全絕對堿基特異的。每組測序圖譜為5條或4條(A>C反應(yīng)可以不做)泳道。需要通過從C+T泳道出現(xiàn)的條帶中扣除C泳道的條帶而推斷T殘基的存在。類似地，A殘基的位置也要通過從A+G泳道中扣除G泳道的條帶推斷出來。同時，如果A>C泳道中出現(xiàn)較強(qiáng)的條帶，則可確證A殘基的存在。實際讀片時從膠片底部一個個地向頂部讀取。從下至上，一個一個地從G+A泳道和C+T泳道二個列中確定只相差一個堿基的條帶。如果在G+A泳道中出現(xiàn)一條帶，就看G泳道中是否有相同大小的帶，如果有即為G堿基，如果沒有則為A堿基；同樣，在C+T泳道中出現(xiàn)的條帶，就檢查C泳道中有無同樣大小的條帶，如果有即為C,無則為T。如果做了A>C反應(yīng)，在該列中出現(xiàn)較強(qiáng)的條帶時，可幫助A的確定。優(yōu)點：化學(xué)降解法進(jìn)行測序不僅重復(fù)性更高，而且由于只需要簡單的化學(xué)試劑和一般的實驗條件，易為掌握。Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進(jìn)行測序可以分析DNA甲基化修飾情況可以通過化學(xué)保護(hù)及修飾等干擾實驗來研究DNA的二級結(jié)構(gòu)研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用缺點：如同雙脫氧終止法一樣，化學(xué)降解法測序的主要限制因素也是測序凝膠的分辨能力?；瘜W(xué)測序法一般都用32P標(biāo)記，所以與用32S標(biāo)記作標(biāo)記的末端終止法相比，它顯示的條帶較寬且有擴(kuò)散現(xiàn)象，這限制了化學(xué)降解法在對較大DNA片段測序時的分辨能力。一般一塊電泳膠上最多能讀出200~250核苷酸序列。然而，如果按2個相反的取向分別從DNA片段的兩端進(jìn)行測序，則可克服這一不足?！?雜交測序法（SBH）（Sequencingbyhybridization）雜交測序：DNA芯片技術(shù)通過大量固化的寡核苷酸探針與生物樣品的靶序列進(jìn)行分子雜交，根據(jù)產(chǎn)生的雜交圖譜排列出靶DNA的序列，這種測序方法稱為雜交測序（sequencingbyhybridization,SBH）。基本原理：用特定長度的具有所有可能堿基序列的寡核苷酸探針與未知序列的DNA片段雜交；根據(jù)某些探針形成的雙鏈，推知目的DNA的堿基序列。?優(yōu)點：迅速、成本低、易于自動化-存在問題：雜交條件難確定，易出現(xiàn)假陽性和假陰性的雜交結(jié)果；無法確定重疊序列；重復(fù)序列難確定?！?DNA芯片測序法生物芯片：指通過機(jī)器人自動印跡或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。生物芯片的分類（一）按載體材料分類玻璃芯片硅芯片陶瓷芯片。（二）按點樣方式分類原位合成芯片微矩陣芯片3.電定位芯片（三）按芯片固定的生物分子類型分類基因芯片蛋白質(zhì)芯片芯片實驗室（四）按芯片的使用功能分類測序芯片表達(dá)譜芯片基因差異表達(dá)分析芯片?原位合成芯片：它將半導(dǎo)體中的光蝕刻技術(shù)運用到DNA合成化學(xué)中，以單核苷酸或其他生物大分子為底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，從而制備成芯片。?微矩陣芯片：將用PCR或化學(xué)合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用針點或噴點方法直接排列到玻片等載體，從而制備成芯片。特點是密度高、制作方便。?電定位芯片：是利用靜電吸附的原理將DNA快速定位在硅基質(zhì)、導(dǎo)電玻璃上，從而制備成芯片。特點是在電力推動下可使雜交快速進(jìn)行，但制作工藝復(fù)雜，點樣密度低?基因芯片技術(shù)（genechip）:就是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)度及分布進(jìn)而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息。?蛋白質(zhì)芯片（proteinchip）:就是選擇一種能夠牢固地結(jié)合蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體）的固相載體，在上面按預(yù)先設(shè)計的方式固定大量蛋白質(zhì)（抗原或抗體），形成蛋白質(zhì)的微陣列，然后加入與之特異性結(jié)合的帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體），通過對標(biāo)記物的檢測來實現(xiàn)抗原抗體的互檢。芯片實驗室（lab-on-chip）:是將納米技術(shù)引入生物芯片，在微小的硅材料表面，制造出能夠?qū)ξ⒘繕悠愤M(jìn)行變性、分離、純化、電泳、PCR擴(kuò)增、加樣及檢測等微小結(jié)構(gòu)，使過去一個實驗的各個實驗步驟微縮于一個芯片上,這種技術(shù)稱為芯片實驗室?！?基因芯片制作及應(yīng)用基因芯片技術(shù)的概念就是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)度及分布進(jìn)而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息?；驹恚夯蛐酒墓ぷ髟砼c經(jīng)典的核酸分子雜交方法一致，應(yīng)用已知核酸序列作為靶基因與互補(bǔ)的探針核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性與定量分析。具體講即是將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品DNA/RNA通過PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基配對原理將兩者進(jìn)行雜交；再通過熒光或同位素檢測系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描，由計算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的信號作出比較和檢測，從而得出所需要的信息。基因芯片技術(shù)主要包括五個主要步驟：芯片制作樣品制備分子雜交信號檢測結(jié)果分析?特點：①微型化和自動化?，F(xiàn)已出現(xiàn)的芯片面積最大不過525cm2，最小僅有1cm2,每個陣列中陣點樣品DNA的用量僅為5nl(0.5gg/gL)左右;同時雜交和洗片等過程都可實現(xiàn)自動化，工作效率大幅度提高。-②高度平行性。基因芯片技術(shù)是將待研究的基因制作成芯片，并在同一張芯片上同時對實驗組和對照組材料進(jìn)行雜交分析，從而使實驗結(jié)果具有可比性.-③巨大的信息產(chǎn)出率。在一張芯片上不僅可以獲得組織、細(xì)胞、血液等基因表達(dá)信號的定性、定量分析，還可實現(xiàn)全局檢測靜態(tài)到動態(tài)、時間與空間上的差異及遺傳信息。-④高度敏感性和專一性。能可靠并準(zhǔn)確檢測出10pg/應(yīng)的DNA樣品。-⑤高度重復(fù)性。一張由尼龍膜制作的微陣列，可以重復(fù)雜交使用多達(dá)20次。-⑥強(qiáng)大的類比性。使得以往需多次處理的遺傳分析在同一時間和條件下快速完成。-⑦哺育新的實驗方法。此技術(shù)易與其它常規(guī)生物技術(shù)相融合交叉?；蛐酒@些獨一無二的特點也代表了后基因組時代技術(shù)的發(fā)展方向?；蛐酒膽?yīng)用基因表達(dá)分析：人類基因組編碼大約100,000個不同的基因，僅掌握基因序列信息資料，要理解其基因功能是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此，具有監(jiān)測大量mRNA的實驗工具很重要?基因芯片技術(shù)可清楚地直接快速地檢測出以1:300,000水平出現(xiàn)的mRNA，且易于同時監(jiān)測成千上萬的基因。?基因表達(dá)譜芯片應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)上也最成熟。這種芯片可以檢測整個基因組范圍的眾多基因在mRNA表達(dá)水平的變化。它能對來源于不同個體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況進(jìn)行對比分析。從而對基因群在個體特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特異性、疾病特異性、刺激特異性的變化特征和規(guī)律進(jìn)行描述。?進(jìn)一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互為因果等關(guān)系。有助于理解基因及其編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，并從已知生物學(xué)功能的基因推論未報道基因的生物學(xué)意義。同時，還可在基因水平上解釋疾病的發(fā)病機(jī)理，為疾病診斷、藥效跟蹤、用藥選擇等提供有效手段。?急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表達(dá)譜芯片的研究。?基因型及多態(tài)性分析：利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(ASOs)微陣列建立了簡單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價固定于玻璃載片上，采用PCR擴(kuò)增基因組DNA，其一條引物用熒光素標(biāo)記，另一條引物用生物素標(biāo)記，分離兩條互補(bǔ)的DNA鏈，將熒光素標(biāo)記DNA鏈與微陣列雜交，通過熒光掃描檢測雜交模式，即可測定PCR產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性，該方法對人的酪氨酸酶基因第4個外顯子內(nèi)含有的5個單堿基突變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單堿基錯配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。?疾病的診斷與治療:尋找和檢測與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測致病基因的表達(dá)?基因芯片在感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨特的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)檢測方法相比，它可以在一張芯片同時對多個病人進(jìn)行多種疾病的檢測；無需機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，能及早診斷，待測樣品用量?。荒軝z測病原微生物的耐藥性，病原微生物的亞型；極高的靈敏度和可靠性；檢測成本低，自動化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。這些特點使得醫(yī)務(wù)人員在短時間內(nèi)，可以掌握大量的疾病診斷信息，這些信息有助于醫(yī)生在短時間內(nèi)找到正確的治療措施。?藥物研究與開發(fā)：芯片技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、平行性等特點可以進(jìn)行新藥的篩選，尤其對中藥有效成分進(jìn)行篩選。采用基因芯片技術(shù)來尋找藥物靶標(biāo)，查檢藥物的毒性或副作用，用芯片作大規(guī)模的篩選研究可以縮短藥物篩選所用時間。-基因功能研究：在基因組學(xué)和后基因組學(xué)研究中，應(yīng)用基因芯片可以開展DNA測序、基因表達(dá)檢測、基因突變性、基因功能研究、尋找新基因、單核苷酸多態(tài)性（SNP）測定等研究。與傳統(tǒng)的Northernblot雜交或點雜交方法相比，基因芯片技術(shù)具有大規(guī)模平行處理的能力。-在營養(yǎng)與食品衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用：采用基因芯片技術(shù)研究營養(yǎng)素與蛋白和基因表達(dá)的關(guān)系，將為揭示肥胖的發(fā)生機(jī)制及預(yù)防打下基礎(chǔ)。還可用于營養(yǎng)與腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究，營養(yǎng)與心腦血管疾病關(guān)系的分子水平研究。再者，食品營養(yǎng)成分的分析、食品中有毒、有害成分的分析和檢測等。-在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：可以快速檢測污染微生物或有機(jī)化合物對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，同時也能夠通過大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。-農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)：利用基因芯片技術(shù)，對有重要經(jīng)濟(jì)價值的農(nóng)作物和水果等的基因組進(jìn)行大規(guī)模高通量的研究，篩選農(nóng)作物的基因突變，并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關(guān)基因，以開發(fā)高技術(shù)含量、高附加值的新產(chǎn)品。也可利用基因芯片技術(shù)篩選、開發(fā)高效低毒的生物農(nóng)藥。-軍事和司法：美國以有部分公司得到政府的資助開發(fā)生物戰(zhàn)病原體檢測系統(tǒng)。在司法領(lǐng)域，國外的公司正在開發(fā)便攜式DNA芯片檢測裝置，它可以直接在犯罪現(xiàn)場對可能是疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進(jìn)行分析，并立刻與DNA罪犯指紋庫系統(tǒng)存儲的DNA“指紋”進(jìn)行比較，以盡快、準(zhǔn)確的破案。我國上海的司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所第一個“罪犯DNA數(shù)據(jù)庫”在99年9月7日通過了專家鑒定，利用DNA破案將成為一種重要的破案手段。另外，基因芯片還可作親子鑒定等方面的工作。基因芯片測序的基本原理：將各種排列順序的寡核苷酸片段點播在芯片上，每個點播的寡核苷酸片段在排列的方陣中都有指定的位置。待檢測的DNA分子與芯片溫浴，凡是能雜交的寡核苷酸片段都會在確定位置發(fā)出信號，然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸片段的順序進(jìn)行對比組裝，拼接成完全的DNA順序。§5隨機(jī)測序法隨機(jī)測序也稱“鳥槍法”。序列組裝原理：直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸。優(yōu)點：不需預(yù)先了解任何基因組的情況.鳥槍測序法（shotgunsequencing）大分子DNA被隨機(jī)地“敲碎”成許多小片段，收集這些隨機(jī)小片段并將它們?nèi)窟B接到合適的測序載體（如M13噬菌體）；小片段測序完成后，根據(jù)重疊區(qū)計算機(jī)將小片段整合出大分子DNA序列，這就是所謂的鳥槍測序法。缺點：對于分子量較大的待測基因組，測序工作量大，且易造成重復(fù)測定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復(fù)序列，導(dǎo)致判斷失誤。對策：引物步移策略定向缺失克隆策略染色體步查法其它將待測DNA片斷克隆在質(zhì)粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片斷的一端開始逐步進(jìn)行序列測定，直至另一端為止?？朔锁B槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了數(shù)據(jù)分析工作量。但由于測定下一段序列前要預(yù)先知道上游序列的堿基順序，才能合成適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行測序?；蚪M測序基因組的測序的步驟：建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC克隆、細(xì)菌人工染色體BAC(BacterialArtificialChromosome)克隆等；利用鳥槍法測定每個克隆的序列；序列拼裝和注釋：當(dāng)?shù)玫揭欢蜠NA序列之后，可以利用序列分析工具，進(jìn)行序列的拼接；繼而通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關(guān)的信息，如基因、調(diào)控元件、重復(fù)區(qū)域等，進(jìn)而對序列的生物學(xué)特性進(jìn)行注釋。基因組DNA序列測定示意圖通過隨機(jī)剪切得到的大分子DNA片段克隆到載體上。繪制出這些重疊片段的圖譜，并對重疊片段進(jìn)行測序，通過“拼裝”得到基因組序列。另一種方法不是根據(jù)片段的染色體位置，而是根據(jù)其重疊部分進(jìn)行“拼裝”。§6EST測序基本原理：EST測序(Expressedsequencetag)是一種重要的基因組圖分子標(biāo)記，以EST為探針很容易從cDNA文庫中篩選全基因，又可從BAC克隆中找到其基因組的基因序列。優(yōu)點：mRNA可直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而且cDNA文庫也比較容易構(gòu)建；對cDNA文庫大量測序，即可獲得大量EST的序列；EST為基因的編碼區(qū)，不包括內(nèi)含子和基因間區(qū)域，一次測序的結(jié)果足以鑒定所代表的基因；§7電子克隆表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetags，EST)是對某個基因cDNA克隆測序所得的部分序列片段，長度大約為200~600bp。?由于基因表達(dá)調(diào)控作用不同，同一個基因的mRNA剪接位點和方式不同，所以同一個基因的全長cDNA可能包含多個EST。EST既代表了基因cDNA的某一區(qū)段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式。電子克隆技術(shù)是生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中EST數(shù)據(jù)庫、核酸序列數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)據(jù)庫，采用同源性序列比對和歸類分析、重疊區(qū)域組裝和拼接等方法延長EST序列，直至沒有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認(rèn)為是相對應(yīng)基因的全長cDNA，根據(jù)所得的cDNA序列設(shè)計囊括開放閱讀框兩端的引物，進(jìn)行RT-PCR克隆出相應(yīng)基因的方法?；驹鞥ST是從一個隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5'端和3'端一次測序獲得的短的cDNA部分序列，代表一個完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫中其長度一般從20到7000bp不等，平均長度為360±120bp。EST來源于一定環(huán)境下一個組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫，因此EST也能說明該組織中各基因的表達(dá)水平。相近的物種在核酸序列上有相似性，相近物種中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列。可代表程度與兩序列的相似度直接相關(guān)，加之遺傳密碼的簡并性，這種混同在理論上是可行的，但需要作同源性檢驗以克服主觀因素的影響。借助計算機(jī)找到具有相同或相似圖案的圖塊，拼成完整的圖案，我們需要做的是進(jìn)行局部的微調(diào)。剩下的工作就是對拼接出的cDNA進(jìn)行可能的開放閱讀框的分析，設(shè)計囊括開放閱讀框兩端的引物，RT-PCR擴(kuò)增侯選基因。在人類基因組研究中，有一個區(qū)別于“全基因組戰(zhàn)略”的“cDNA戰(zhàn)略”，既只測定轉(zhuǎn)錄的DNA序列，也就是測定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的互補(bǔ)DNAcDNA.cDNA代表了基因中編碼蛋白質(zhì)的序列。EST則是cDNA的一個片段，一般長200-400個核苷酸對。一個全長的cDNA