基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工及逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(transcription)是以DNA單鏈為模板，NTP為原料，在DNA依賴的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過程。與DNA的復(fù)制相比，有很多相同或相似之處，亦有其特點(diǎn)，它們之間的異同可簡要示于表13-1表1M1轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的異同p差異相同p轉(zhuǎn)錄復(fù)制或相候/模板?基因的模板鍍轉(zhuǎn)錄a股融至復(fù)制DNA^原料NTPdNTF核宜三磷酸中蹶基配對(duì)A-U,T-A；G--QA-T；G-C能從6?基配對(duì)原則叱聚合前DNA聚合酶依賴DNA的聚合酶弁物tRNA,rl^NA等DNA多核甘酸鏈/轉(zhuǎn)錄的模板是單鏈DNA，與復(fù)制的模板有較多的不同特點(diǎn)，引出了下列相關(guān)概念。轉(zhuǎn)錄過程只以基因組DNA中編碼RNA(mRNA、tRNA、rRNA及小RNA)的區(qū)段為模板。把DNA分子中能轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因(structuregene)。結(jié)構(gòu)基因的雙鏈中，僅有一股鏈作為模板轉(zhuǎn)錄成RNA，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作Watson(叩)鏈(Watsonstrand)、負(fù)(-)鏈(minusstrand)或反意義鏈(antisensestrand)。與模板鏈相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)鏈，其編碼區(qū)的堿基序列與mRNA的密碼序列相同(僅T、U互換)，稱為編碼鏈(codingstrand)，也稱作Crick(0鏈(Crickstrand)、正(+)鏈(plusstrand)，或有意義鏈(sensestrand)。不同基因的模板鏈與編碼鏈，在DNA分子上并不是固定在某一股鏈，這種現(xiàn)象稱為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)。模板鏈在相同雙鏈的不同單股時(shí)，由于轉(zhuǎn)錄方向都從5’一3’，表觀上轉(zhuǎn)錄方向相反，如圖13-1。與DNA復(fù)制類似，轉(zhuǎn)錄過程在原核生物和真核生物中所需的酶和相關(guān)因子有所不同，轉(zhuǎn)錄過程及轉(zhuǎn)錄后的加工修飾亦有差異。下面的討論中將分別敘述。參與轉(zhuǎn)錄的酶轉(zhuǎn)錄酶(transcriptase)是依賴DNA的RNA聚合酶(DNAdependentRNApolymerase，DDRP)，亦稱為DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶(DNAdirectedRNApolymerase)，簡稱為RNA聚合酶(RNApol)。它以DNA為模板催化RNA的合成。原核生物和真核生物的轉(zhuǎn)錄酶，均能在模板鏈的轉(zhuǎn)錄起始部位，催化2個(gè)游離的NTP形成磷酸二酯鍵而引發(fā)轉(zhuǎn)錄的起始，如圖13-2所示。因此，轉(zhuǎn)錄的起始不需引物，這也是轉(zhuǎn)錄與復(fù)制在起始階段的一大區(qū)別。一、原核生物的RNA聚合酶細(xì)菌中只發(fā)現(xiàn)一種RNA聚合酶，能催化mRNA，tRNA和rRNA等的合成，研究得比較清楚的是大腸桿菌（Ecoli）的RNA聚合酶。（一）大腸桿菌RNA聚合酶的組成大腸桿菌RNA聚合酶的分子量約450kDa，由四種5個(gè)亞基（a2BB'。）組成全酶（holoenzyne），。亞基與全酶疏松結(jié)合，在胞內(nèi)、外均容易從全酶中解離，解離后的部分（a2BB'）稱為核心酶（coreenzyme）。通過利福霉素等抑制轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)轉(zhuǎn)錄酶各亞基的功能已有一定的認(rèn)識(shí)：a亞基可能參與全酶的組裝及全酶識(shí)別啟動(dòng)子，從而決定哪些基因可轉(zhuǎn)錄；B亞基與底物（NTP）及新生RNA鏈結(jié)合；B'亞基與模板DNA結(jié)合；B和B'亞基組成酶的活性中心，通過DNA的磷酸基團(tuán)與核心酶的堿性基團(tuán)間的非特異性吸附作用，核心酶能與模板DNA非特異性松馳結(jié)合；。亞基的功能是識(shí)別啟動(dòng)子，辯認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，但不能單獨(dú)與DNA模板結(jié)合，當(dāng)它與核心酶結(jié)合時(shí)，可引起酶構(gòu)象的改變，從而改變核心酶與DNA結(jié)合的性質(zhì)，使全酶對(duì)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的親和力比其他部位高4個(gè)數(shù)量級(jí)，在轉(zhuǎn)錄延長階段，。亞基與核心酶分離，僅由核心酶參與延長過程。因此，。亞基實(shí)際上被認(rèn)為是一種轉(zhuǎn)錄輔助因子，因而稱為。因子（ofactor）。（二）。因子生物體在生命周期的不同階段或在內(nèi)、外環(huán)境有所變化時(shí)，其基因表達(dá)有一定的時(shí)、空順序，以適應(yīng)生長、發(fā)育及環(huán)境變化的需要°RNA聚合酶的活性是決定基因表達(dá)的重要一環(huán)。而。因子是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合啟動(dòng)子的亞基，原核生物中所有RNA的轉(zhuǎn)錄都由同一種RNA聚合酶催化，在生命周期的不同階段或不同環(huán)境下，這個(gè)酶如何識(shí)別所有轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子，是由識(shí)別啟動(dòng)子的。因子來完成的?；騿?dòng)子-35和-10區(qū)的共有序列（圖13-3）是。因子識(shí)別的位點(diǎn)，如表13-2所示，不同的。因子能識(shí)別的共有序列可以完全不同。二、真核生物的RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶已發(fā)現(xiàn)有三種，稱為RNA聚合酶I、II和III，分別負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄不同的RNA，它們對(duì)特異性抑制劑鵝膏蕈堿的敏感性亦有差異，如表13-3所示。第二節(jié)轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄是生物合成RNA的過程，與復(fù)制相似，有起始、核苷酸鏈延長和鏈合成終止三個(gè)階段。一、轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始，就是形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的過程。這一階段反應(yīng)所需的輔助因子，在原核生物與真核生物之間有較大的差異。㈠原核生物轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始由RNA聚合酶與DNA模板的啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合。經(jīng)過對(duì)百種以上原核生物不同基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子具有下列的共同點(diǎn)：在-10bp處有一段共有序列(consensussequence),富含AT,即-TATAAT-，系Pribnow等首先發(fā)現(xiàn)，因而稱為Pribnow盒(box)，再往上游-35bp的中心處又有一組保守的共有序列，即-TTGACT-。啟動(dòng)子鄰近的結(jié)構(gòu)示如圖13-3。結(jié)合過程可分為二個(gè)步驟，首先由。因子辨認(rèn)啟動(dòng)子的-35區(qū)，全酶與該區(qū)結(jié)合，形成疏松的復(fù)合物，此時(shí)DNA雙鏈未解開，因而稱為封閉型轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，繼而RNA聚合酶移向-10區(qū)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，在-20區(qū)處DNA發(fā)生局部解鏈，形成12?17bp的單鏈區(qū)，RNA聚合酶與DNA結(jié)合更緊密，形成開放型轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。以單鏈的模板鏈為模板，RNA聚合酶上的起始位點(diǎn)和延伸位點(diǎn)被相應(yīng)的NTP占據(jù)，聚合酶的B亞基催化第一個(gè)磷酸二酯鍵的生成，。亞基從全酶解離，形成DNA-RNA聚合酶(核心酶)結(jié)合在一起的起始延伸復(fù)合物。㈡真核生物轉(zhuǎn)錄的起始真核生物有三種RNA聚合酶，分別催化不同RNA的合成，每種酶都需要一些蛋白質(zhì)輔助因子，稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)。為方便討論，轉(zhuǎn)錄因子的命名冠以聚合酶的名稱。如RNA聚合酶II所需的轉(zhuǎn)錄因子稱為轉(zhuǎn)錄因子II(transcriptionfactor!,TFII)。RNA聚合酶I催化的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶I催化前rRNA(40SRNA)的合成。前rRNA基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游有兩個(gè)順式作用元件(cisactingelement)，一個(gè)是跨越起始點(diǎn)的核心元件(coreelement)，另一個(gè)在-100bp處有上游調(diào)控元件(upstreamcontrolelement,UCE)。RNA聚合酶I催化的轉(zhuǎn)錄需要2種轉(zhuǎn)錄因子，分別稱為上游結(jié)合因子(upstreambindingfactor,UBF)和選擇性因子1(selectivefactor1,SL1)。SL1含有4個(gè)亞基，一個(gè)是TATA盒結(jié)合蛋白(TATA-bindingprotein,TBP)，另3個(gè)是TBP相關(guān)因子(TBP-associatedfactors,TAF)。UBF與DNA結(jié)合令模板DNA發(fā)生彎曲，使相距上百bp的UCE和核心元件靠攏，接著SL1和poll相繼結(jié)合到UBF-DNA復(fù)合物上，完成起始復(fù)合物的組建，開始轉(zhuǎn)錄，如圖13-4所示。RNA聚合酶II催化的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶II催化各種前體mRNA的合成。研究表明，RNA聚合酶II催化的轉(zhuǎn)錄起始需要較多的轉(zhuǎn)錄因子參與。為了便于討論，它們的命名是在轉(zhuǎn)錄因子II(TFII)后加上大寫字母，分別稱為TFIIAJ。RNA聚合酶II結(jié)合的啟動(dòng)子的特點(diǎn)是，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游有三處參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的保守序列或稱為順式作用元件。在-90bp處有核心序列為GGGCGG的GC盒，-70bp處有共有(consensus)序列為GGC(T)CAATCT的CAAT盒，-30bp處有共有序列為TATAA(T)AAT的TATA盒，又稱Hogness盒(Hognessbox)。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與原核生物相似，大多數(shù)為A或G。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝：如圖13-5。3.RNA聚合酶皿催化的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶III催化tRNA，5SrRNA和7SrRNA的轉(zhuǎn)錄。tRNA基因轉(zhuǎn)錄的起始：tRNA基因的轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物是tRNA的前體，經(jīng)加工后產(chǎn)生多個(gè)成熟tRNA。在DNA上的調(diào)控序列位于起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的下游，稱為內(nèi)部啟動(dòng)子。有二個(gè)調(diào)控區(qū)，分別位于編碼tRNAD-環(huán)和TW環(huán)的序列，分別稱為A盒和B盒。如圖3-6所示。5SRNA基因轉(zhuǎn)錄的起始：5SRNA基因的轉(zhuǎn)錄除了需要TFIIIB和TFIIIC外，還需要TFIA，首先由TFIA結(jié)合到起始位點(diǎn)下游81?99bp處(C盒)，然后TFIIIC結(jié)合到A盒和B盒，繼而是類似tRNA的轉(zhuǎn)錄，TFIIIB與TFIIIC作用，和聚合酶I的結(jié)合，即可起始轉(zhuǎn)錄。二、轉(zhuǎn)錄的延長轉(zhuǎn)錄延長階段發(fā)生的反應(yīng)，在原核生物和真核生物比較相近。總的來說，一是聚合酶如何向轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游移動(dòng)，繼續(xù)指導(dǎo)核苷酸之間磷酸二酯鍵的形成，二是轉(zhuǎn)錄區(qū)的模板如何形成局部單鏈區(qū)，便于轉(zhuǎn)錄。原核生物RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄起始，即核苷酸鏈中的第一個(gè)磷酸二酯鍵形成后，。因子從全酶中解離出來，核心酶就能沿DNA分子移動(dòng)，真核生物RNA聚合酶不僅需要較多的轉(zhuǎn)錄因子來催化起始，而且轉(zhuǎn)錄起始后，酶的移動(dòng)也靠多種轉(zhuǎn)錄因子的共同作用使酶的構(gòu)象發(fā)生改變來實(shí)現(xiàn)，如在TFIIH等作用下，聚合酶IIC端絲氨酸殘基的磷酸化是聚合酶向下游移動(dòng)的重要因素。在轉(zhuǎn)錄延長過程中，DNA雙鏈需解開10?20bp，形成的局部單鏈區(qū)象一個(gè)小泡，故形象地稱為轉(zhuǎn)錄泡(transcriptionbubble)。轉(zhuǎn)錄泡是指RNA聚合酶-DNA模板-轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA結(jié)合在一起形成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。為了保持局部的轉(zhuǎn)錄泡狀態(tài)，在RNA聚合酶下游的DNA需不斷解鏈，可使其下游的DNA(未解開雙鏈部分)越纏越緊，形成正超螺旋，而其上游DNA變得松馳，產(chǎn)生負(fù)超螺旋，需要解旋酶(gyrase)和拓?fù)洚悩?gòu)酶來消除這些現(xiàn)象，如圖13-7。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中，核苷酸之間第一個(gè)磷酸二酯鍵的形成是由第一個(gè)核苷酸的3’-OH與第二個(gè)核苷酸的5’-磷酸之間脫水而成。第一個(gè)核苷酸常為G，來自GTP的5’-三磷酸仍保留，第二個(gè)核苷酸的3’-OH仍然游離形成5'pppGpN-OH3'。在聚合酶沿模板鏈的3'-5'移動(dòng)時(shí)，可按模板鏈堿基序列的指引，相應(yīng)NTP上的a-磷酸可與延長新鏈的3’-OH相繼形成磷酸二酯鍵，其B、Y磷酸基脫落生成焦磷酸后迅速水解，釋放的能量進(jìn)一步推動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使新合成的RNA鏈沿著5'f3’方向逐步延長。在轉(zhuǎn)錄局部形成的RNA：DNA雜化雙鏈之間的引力比DNA雙鏈的弱（因?yàn)殡s化雙鏈間存在dA：rU配對(duì)，dA：rU的穩(wěn)定性比dA：dT的小），延長中的RNA鏈的5’-端會(huì)被重新形成的DNA雙鏈擠出，使合成中的RNA的5’-端游離于轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。三、轉(zhuǎn)錄的終止㈠原核生物轉(zhuǎn)錄的終止原核生物轉(zhuǎn)錄的終止有兩種主要機(jī)制。一種機(jī)制是需要蛋白質(zhì)因子P（Rho）的參與，稱為依賴P因子（Pfactor）的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制，另一種機(jī)制是在離體系統(tǒng)中觀察到，純化的RNA聚合酶不需要其他蛋白質(zhì)因子參與，可使轉(zhuǎn)錄終止，稱為不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制。1依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止：P因子是一種分子量為46kDa的蛋白質(zhì)，以六聚體為活性形式。依賴P因子的終止位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)有特殊的DNA序列，但P因子能與轉(zhuǎn)錄中的RNA結(jié)合。P因子的六聚體被約70?80nt的RNA包繞，激活P因子的ATP酶（ATPase）活性，并向RNA的3’端滑動(dòng)，滑至RNA聚合酶附近時(shí)，RNA聚合酶暫停聚合活性，使RNA：DNA雜化鏈解鏈，轉(zhuǎn)錄的RNA釋放出來而終止轉(zhuǎn)錄。如圖13-8所示。2.不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止：在這種轉(zhuǎn)錄終止系統(tǒng)中，模板DNA在終止位點(diǎn)附近有特殊的連續(xù)T序列，在連續(xù)T之前有富含GC互補(bǔ)區(qū)及幾個(gè)插入堿基，如圖13-9。這種互補(bǔ)區(qū)的轉(zhuǎn)錄物可形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，影響RNA聚合酶的構(gòu)象使轉(zhuǎn)錄暫停；同時(shí)，由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的（rU）n與模板的（dA）n之間的dA：rU雜交區(qū)的雙鏈?zhǔn)亲畈环€(wěn)定的雙鏈，使雜化鏈的穩(wěn)定性下降，而轉(zhuǎn)錄泡模板區(qū)的兩股DNA容易恢復(fù)雙鏈，釋出轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，使轉(zhuǎn)錄終止。㈡真核生物轉(zhuǎn)錄的終止真核生物轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制，目前了解尚不多，而且3種RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止不完全相同°RNA聚合酶I催化的轉(zhuǎn)錄有18bp的終止子序列，可被輔助因子識(shí)別。RNA聚合酶II和III催化轉(zhuǎn)錄的終止子，可能有與原核生物不依賴P因子的終止子相似的結(jié)構(gòu)和終止機(jī)制，即有富含GC的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)（stem-loopstructure）和連續(xù)的U。由于成熟的mRNA3’端已被切除了一段并加入了polyA尾,具體的轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)目前尚未認(rèn)識(shí)。四、轉(zhuǎn)錄的抑制作用(一)作用于模板DNA的轉(zhuǎn)錄抑制劑如放線菌素D(actinomycinD),能插入至DNA雙鏈中兩對(duì)dG?dC之間，低濃度時(shí)，阻止RNA鏈的延長，高濃度時(shí)可抑制RNA的起始，也抑制DNA復(fù)制。(二)作用于RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄抑制劑如利福平或利福霉素，能與原核細(xì)胞RNA聚合酶的B亞基非共價(jià)結(jié)合，阻止RNA轉(zhuǎn)錄的起始，對(duì)真核生物RNA聚合酶無作用。該藥臨床用于治療結(jié)核桿菌引起的疾病。a鵝膏蕈堿則是真核生物RNA聚合酶II的抑制劑。第三節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄后的加工一、原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，一般無需加工已具有活性，即可作為翻譯的模板，近年也發(fā)現(xiàn)需要添加3’polyA的現(xiàn)象。而對(duì)rRNA和tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工、修飾了解比較多，分別敘述如下：㈠rRNA的加工㈡tRNA的加工RNA酶III：RNA酶D：RNA酶P：tRNA核昔酸轉(zhuǎn)移酶：II型tRNA沒有3’端的CCA，I型tRNA的3’端CCA亦有被核酸酶降解的可能性。此酶以ATP和CTP為原料催化tRNA3’端CCA的形成。二、真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工㈠rRNA轉(zhuǎn)錄后的加工真核生物的rRNA有5S、5.8S、18S和28S四種，其中5.8S、18S和28S是由RNA聚合酶I催化一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，產(chǎn)生45SrRNA前體，rRNA轉(zhuǎn)錄后加工包括前體rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，然后再切割和甲基化。在研究rRNA轉(zhuǎn)錄加工的過程中，發(fā)現(xiàn)某些真核生物如四膜蟲(Trtrahymena)的26SrRNA的前體為6.4kb，含有414核苷酸的內(nèi)含子，可以在完全沒有蛋白質(zhì)的條件下，自身剪接，能很準(zhǔn)確地將414核苷酸內(nèi)含子剪除，而使兩個(gè)外顯子相連接為成熟的26SRNA。這種具有催化功能的RNA稱為核酶（ribozyme），意為可切割特異性RNA序列的RNA分子。核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)有多種，其中一種呈槌頭狀（hammerhead）結(jié)構(gòu)，含有若干莖（stems）和環(huán)（loops）。例如煙草環(huán)斑（rinsport）病毒的衛(wèi)星RNA的自身剪接序列具有槌頭狀結(jié)構(gòu)，如圖13-11所示。根據(jù)核酶的槌頭狀結(jié)構(gòu)，通過人工設(shè)計(jì)合成，可使原來沒有核酶活性的RNA，成為具有核酶活性的RNA，用于阻斷病源生物或腫瘤基因的表達(dá)，為對(duì)感染性疾病及腫瘤的治療提供了新的思路。如圖13-12所示，下半部的24核苷酸鏈，是沒有核酶活性的病原體或腫瘤的RNA，，根據(jù)槌頭狀結(jié)構(gòu)原理，人工設(shè)計(jì)合成上半部的19核苷酸鏈，與其配成槌頭狀結(jié)構(gòu)，使下半部分成為人工核酶的特異切割部位，阻斷其表達(dá)，達(dá)到防治某些疾病的目的。例如，現(xiàn)已在探索用核酶來破壞人免疫缺陷病毒（HIV）的臨床治療方案。㈡tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工前tRNA的加工包括切除和堿基修飾，有些則需剪接。前tRNA的堿基約有10%需要酶促修飾，修飾有如下類型：①前tRNA3’端的U由CCA取代；②嘌吟堿或核糖C2’的甲基化；③尿苷被還原成雙氫尿苷（DH）或核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)，成為假尿嘧啶核苷（TW）；④某些腺苷酸脫氨成為次黃嘌吟核苷酸（AMP-IMP）。㈢mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工真核生物mRNA由RNA聚合酶II催化轉(zhuǎn)錄，初始產(chǎn)物為核不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA），新生的hnRNA從開始形成到轉(zhuǎn)錄終止，就逐步與蛋白質(zhì)結(jié)合形成不均一核糖核蛋白（hnRNP）顆粒，前mRNA加工的順序是形成5’帽子結(jié)構(gòu)；內(nèi)切酶去除3’端的一段序列；polyA聚合酶催化形成3’polyA尾；最后是剪接去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA。1.5'帽的形成：hnRNA5’端的第一個(gè)核苷酸通常為三磷酸鳥苷（5’-pppGpN-），在磷酸酶催化下去除Y-磷酸基團(tuán)形成5’-ppGpN???，經(jīng)鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶催化與另一個(gè)GTP（pppG）作用生成GpppGpN???，在鳥嘌吟-7-甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，以S-腺苷蛋氨酸為甲基來源，生成m7GpppGpN???，再經(jīng)2’甲基轉(zhuǎn)移酶催化，使5’端原來的第一位，甚至第二位核苷酸的2’-O位甲基化，形成m7GpppGmN**?，或m7GpppGpmNm????？梢?’帽結(jié)構(gòu)有三種形式；m7GpppGpN???為帽0，m7GpppGmpN???為帽1，m7GpppGmpNm???為帽2。不同真核生物的mRNA或同一生物的不同mRNA有不同的5’帽結(jié)構(gòu)。2.前mRNA3’端切除及加polyA尾：除組蛋白的mRNA外，真核生物的所有mRNA都有3’polyA尾。研究表明，由于結(jié)構(gòu)基因中編碼鏈的3’端沒有polyA序列，mRNA的polyA尾是轉(zhuǎn)錄后加工形成的，其過程是：加polyA位點(diǎn)上游10?35核苷酸處有AAUAAA序列，下游約50核苷酸處有富含GU序列，這兩處序列是剪切和加polyA所需的信號(hào)。首先由剪切和聚腺苷化特異因子（cleavageandpolyadenylationspecificfactor，CPSF）結(jié)合到上游富AAUAAA序列，剪除刺激因子（cleavagestimulationfactor，CSF）與下游富含GU序列作用，剪除因子I、II（cleavagefactor，CF）相繼與之結(jié)合，使其更趨穩(wěn)定。在剪除之前，polyA聚合酶結(jié)合到復(fù)合物上，使剪切后游離的3’端能迅速腺苷酸化。polyA的生成分二個(gè)階段，如圖13-14。mRNA的剪接：真核生物編碼mRNA的基因是斷裂基因，有外顯子和內(nèi)含子并共同轉(zhuǎn)錄于初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，須將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的內(nèi)含子去除，并把外顯子連接為成熟的mRNA分子，這個(gè)過程稱為剪接（splicing），剪接位點(diǎn)在外顯子的3’端與內(nèi)含子的5’端連接點(diǎn)及內(nèi)含子3’端與下一個(gè)外顯子5’端連接點(diǎn)。為便于敘述，把位于內(nèi)含子5’端的剪切點(diǎn)稱為5’端剪接點(diǎn)，位于內(nèi)含子3’端的剪切點(diǎn)稱為3’端剪接點(diǎn)。從圖13-15中可見，幾乎所有真核生物的核前mRNA都有特征的GU、AG序列，稱為GU-AG規(guī)則。內(nèi)含子離3’剪切點(diǎn)20?50bp范圍有一個(gè)A也是不變的，稱為分支點(diǎn)。分支點(diǎn)附近有保守序列，如UACUAAC，其中3’端倒數(shù)第二個(gè)堿基A為分支點(diǎn)。剪接過程：（四）RNA編輯RNA編輯（RNAediting）是指RNA前體除上述加帽、添尾、剪接、修飾等程序外，需對(duì)其序列進(jìn)行改編，改編過程包括在RNA前體分子中插入、剔除、或置換一些核苷酸殘基。例如人的載脂蛋白B（ApoB）有兩種形式，一種是肝細(xì)胞合成的分子量為512kDa的ApoB-100，參與細(xì)胞內(nèi)合成的脂類的運(yùn)輸；另一種在小腸細(xì)胞合成的分子量為240kDa的ApoB-48，參與以乳糜微粒形式攜帶食物中的脂類。這是由mRNA合成后在其第2153位密碼子CAA（谷氨酰胺）的C變成U而成UAA（終止子），所以蛋白質(zhì)合成到此密碼子即終止，產(chǎn)生含2152氨基酸殘基的ApoB-48，未被編輯的mRNA則翻譯成含4536氨基酸殘基的ApoB-100（圖13-18）。由于催化胞嘧啶變成尿嘧啶的脫氨酶只存在于小腸，故ApoB-48只在小腸合成，所以RNA編輯可以看作是對(duì)生物學(xué)中心法則的一個(gè)重要補(bǔ)充。RNA編輯的多種形式極大地增加了mRNA的遺傳信息容量。第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄病毒及癌基因一、逆轉(zhuǎn)錄病毒及逆轉(zhuǎn)錄酶（一）發(fā)現(xiàn)前節(jié)討論的轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板，在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄成RNA，即信息是從DNA流向RNA。某些病毒的基因組是RNA，而不是DNA，這類病毒稱為RNA病毒。1964年Temin觀察到有些致腫瘤的RNA病毒(如雞肉瘤病毒aviansarcomavirus,ASV)感染細(xì)胞的作用能被DNA復(fù)制抑制劑(如甲氨喋吟，MTX)、5FdUMP等所阻斷，說明ASV的繁殖需要DNA的合成。另一發(fā)現(xiàn)為放線菌素D能抑制子代病毒顆粒的產(chǎn)生。放線菌素D是抑制以DNA為模板的RNA合成，這說明RNA腫瘤病毒在宿主細(xì)胞的繁殖，需要通過細(xì)胞RNA的合成。因此，Temin大膽提出一種設(shè)想，即RNA腫瘤病毒先變成DNA原病毒(provirus)，再產(chǎn)生RNA腫瘤病毒。這意味著遺傳信息也可以從RNA流向DNA。1970年Temin和Baltimore各自發(fā)現(xiàn)RNA腫瘤病毒含有一種酶，稱為逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)。這種酶以RNA為模板，在有4種dNTP存在及合適條件下，能按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，合成互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，cDNA)。這種酶也稱RNA依賴的DNA聚合酶(RNA-dependentDNApolymerase)。由于RNA腫瘤病毒含有這種逆轉(zhuǎn)錄酶，所以也稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)。這一發(fā)現(xiàn)使生物中心法則內(nèi)容更充實(shí)和完善。Temin和Baltimore也因此而獲得諾貝爾獎(jiǎng)金。逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的直徑約為1000?，基因組由兩個(gè)完全相同的單鏈RNA分子組成，每分子約3.5?10kb，不同毒株差異較大，還含有若干分子的逆轉(zhuǎn)錄酶及來自宿主的tRNA。ASV的基因組圖13-19顯示ASV原病毒基因組的結(jié)構(gòu)，兩側(cè)端為長末端重復(fù)序列(1ongterminalrepeat，LTR)，R為兩側(cè)完全相同的序列，U5及U3，則序列不同，兩側(cè)LTR含整合信號(hào)，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子及加polyA等信號(hào)序列，緊接5’端的下游有病毒包裝的序列(中)，是包裝成病毒顆粒的必需信號(hào)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期當(dāng)病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合后，病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，開始病毒的生活周期，有兩個(gè)階。第一階段病毒RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄成DNA前病毒，再整合至宿主基因組中。逆轉(zhuǎn)錄酶具有催化三種反應(yīng)的活性:①RNA指導(dǎo)的DNA合成;②RNA的水解;③DNA指導(dǎo)的DNA合成，如圖13-20所示。合成的起始可能是利用tRNA作為引物。合成的雙鏈DNA原病毒可整合到宿主細(xì)胞的基因組中。第二階段包括已整合至宿主基因組的原病毒DNA，通過宿主細(xì)胞的RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA，此mRNA可作為病毒的RNA基因組，或作為合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的模板。結(jié)果，病毒RNA基因組與病毒蛋白質(zhì)可包裝成新的病毒顆粒進(jìn)行繁殖，后者以芽植式離開宿主，這種逆轉(zhuǎn)錄病毒一般不會(huì)殺死宿主細(xì)胞。二、癌基因與抑癌基因（一）癌基因的概念上述ASV基因組含四個(gè)基因，其中g(shù)ag,pol和env是病毒生活所必需的，而src不是病毒生活必需的。但src基因與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（transformation）和引起動(dòng)物腫瘤有關(guān)，故稱為癌基因（oncogene）。src基因不是病毒生活所必需的，ASV中的src是ASV的前體（不含src）通過重組而獲得細(xì)胞中的src，并突變成癌基因。因此，將病毒中與轉(zhuǎn)化和致癌有關(guān)的基因稱為癌基因，又因?yàn)閬碜圆《?，故加一前綴v-src。而正常細(xì)胞的基因則稱為c-src（c代表cellular），或原癌基因。原癌基因如何轉(zhuǎn)變成癌基因的呢？如上述src被逆轉(zhuǎn)錄病毒獲得后，受到逆轉(zhuǎn)錄病毒順式作用元件一一啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄速度增強(qiáng)，產(chǎn)物量大大增加，可使細(xì)胞轉(zhuǎn)化及惡變。另一種情況是原癌基因發(fā)生染色體移位，或者基因發(fā)生突變而產(chǎn)生異常產(chǎn)物。例如c-Ha-ras的正常產(chǎn)物Ras蛋白（p21）是一類調(diào)控細(xì)胞生長和其他功能的信號(hào)傳導(dǎo)體，當(dāng)Ras蛋白與GTP結(jié)合時(shí)為活化狀態(tài)，GTP水解后，Ras蛋白與GDP的結(jié)合形式即為非活化狀態(tài)。Ras蛋白具有GTP酶的作用，所以在正常生理情況下，這兩種狀態(tài)呈動(dòng)態(tài)平衡。一旦基因發(fā)生突變，如編碼N端第12位氨基酸殘基甘氨酸的密碼子一GGC一突變成一GTC一，而GTC為纈氨酸的密碼子。由于一個(gè)氨基酸的改變，即甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸，可改變Ras蛋白的空間構(gòu)象，使其水解GTP的活性下降1000倍，結(jié)果使Ras蛋白處于與GTP結(jié)合的活化狀態(tài)而造成細(xì)胞惡變。首例