基因芯片與高通量測序

基因芯片：將大量(通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400)探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說，就是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)、乃至百萬計(jì)的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，與計(jì)算機(jī)的電子芯片十分相似,所以被稱為基因芯片.當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列.基因探針是人工合成的堿基序列。，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)度及分布來進(jìn)行分析?；蛐酒ㄟ^應(yīng)用平面微細(xì)加工技術(shù)和超分子自組裝技術(shù)，把大量分子檢測單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測和分析基因芯片制作、芯片制備目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上.芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機(jī)器人技術(shù)。以便能快速、準(zhǔn)確地將探針放置到芯片上的指定位置。2、樣品制備生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，有時(shí)樣品的量很小。所以，必須將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA,然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。3、雜交反應(yīng)雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯(cuò)配率。4、信號檢測和結(jié)果分析雜交反應(yīng)后的芯片上各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)生物信息基因芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)是將從樣品制備、雜交反應(yīng)到信號檢測的整個(gè)分析過程集成化以獲得微型全分析系統(tǒng)(micrototalanalyticalsystem)或稱縮微芯片實(shí)驗(yàn)室(laboratoryonachip).使用縮微芯片實(shí)驗(yàn)室，就可以在一個(gè)封閉的系統(tǒng)內(nèi)以很短的時(shí)間完成從原始樣品到獲取所需分析結(jié)果的全套操作。

與被標(biāo)訕的祥曷分F分子雜交大B探臼與被標(biāo)訕的祥曷分F分子雜交大B探臼4卜了(通帝每平方.匣米點(diǎn)PF酵度高于500}?探針固相原位合成技術(shù)與照相平板印刷技術(shù)臂裝灌將;？tTJ不JC1口七字出位?激光共聚焦顯微技術(shù)-次炷對樣品大量序劌進(jìn)行檢掘和分析，解段了佳統(tǒng)核酸印跡雜交(GcudhErnBlotting和NorthernBlotting等)技術(shù)操作瓣雜、自動(dòng)化程序低、操作序列梵量少、檢測效率低等不足.于固定世持物」-3、/荻取樣品分亍的教量.和序列信總高通量測序：高通量測序技術(shù)(High—throughputsequencing)又稱''下一代"測序技術(shù)("Next-generation"sequencingtechnology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。高通量測序另一個(gè)被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題(短序列，高度同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數(shù)據(jù)“不浪費(fèi)”，同時(shí)測序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。將MS?湖入到。NA片段即3味疆

I在0NA片段的末端加上特定接頭IP6擴(kuò)贈(zèng)連上接頭的DNA片段I文客艦DNA在ClusterStation的成"增IIllumina6enom&Analyzer上的測序生物信息蛆裝/分析川uminaS碘唳蜘!|序流程-—-5,接和純化tpK/3接頭連接純化噬RT-PCR擴(kuò)增TOC\o"1-5"\h\zUb^：:^SmallRNA文庫的純化IB-I文庫的檢測?4DNA在ClustwStation?簇?cái)U(kuò)增4-IlluminaGenomeAnalyzer上的測序I生物信息學(xué)分析Illumina敬亭佻褐因譜測序流程\cDNA第二鏈的合成限制性內(nèi)切酶Nldllt的酶切連接GEXNlalHAdapter1

If限制性內(nèi)切酶MmeT的酶切.、連接GEXAdapter2TOC\o"1-5"\h\zmIAdapterffiScONA產(chǎn)物和PCR富集?I義庫的檢測三二IONA在ClusterStation上的成簇?cái)U(kuò)增IlluminaGenomeAnalyzer上的測序

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生物信息學(xué)分析PCR擴(kuò)增連上接頭的DNA片段生物信息學(xué)分析MMicroRNA測序原理：研究microRNAPCR擴(kuò)增連上接頭的DNA片段生物信息學(xué)分析MMicroRNA測序原理：研究microRNA的方法主要是通過實(shí)時(shí)定量PCR以及基因芯片技術(shù)，這些方法主要關(guān)注microRNA的表達(dá)與定量，并僅局限于研究那些序列信息或二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)信息已知的microRNA，無法尋找和發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。使研究人員能夠直接對樣本中指定大小的所有microRNA分子進(jìn)行高通量測序，在無需任何序列信息的前提下研究microRNA的表達(dá)譜并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)和鑒定新的microRNA分子，并提供了更加靈活和深入的研究分析方法，這是傳統(tǒng)的研究方法所無法比擬的。Illumina轉(zhuǎn)贏組測扁流程mRbW分離和喧機(jī)打斷第二鏈的合成DN點(diǎn)片段的末觥作集貉W,布基山入到DNA片段的3宋在DNA片段的末調(diào)加上特定接頭文審的檢測bNA在CIm十erStatiorkb的成簇?cái)U(kuò)增IlluminaSeiwmeAnalyzer±fflSl!l序氏卻n岬出佬樸阿辛kva西itr玖.誠婦頃JWAAjU^”喉混住&弟.IftdftA邳擴(kuò)■購辛文斯B氏卻n岬出佬樸阿辛kva西itr玖.誠婦頃JWAAjU^”喉混住&弟.IftdftA邳擴(kuò)■購辛文斯MicroRNA芯片:這一技術(shù)的原理是收集待測樣品中的miRNA,與特定芯片上互補(bǔ)的探針雜交，通常待測樣品中的miRNA3’端會(huì)標(biāo)記上熒光基團(tuán)，雜交洗滌后可掃描熒光強(qiáng)度，大量數(shù)據(jù)處理后便可篩選出有顯著表達(dá)差異的miRNA。由于芯片技術(shù)采用大規(guī)