狂犬病病毒分子生物學基礎

狂犬?。≧abies）俗稱“瘋狗病”，是由狂犬病病毒引起的一種接觸性傳染病，呈世界性流行，死亡率幾乎為100%。每年造成超過55,000人死亡，其中99%在亞洲，印度具首位，中國第二位。臨床特征是前期神經(jīng)興奮，后期意識障礙，局部和全身麻痹而死。因采取疫苗接種及綜合防治措施，目前已有日、韓、馬來、澳等36個國家消滅了狂犬病。目前一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點病原狂犬病病毒：Rabiesvirus,RV。有兩種主要抗原：一種是外膜上的糖蛋白抗原，為主要抗原，決定病毒的嗜神經(jīng)性、致病性和產(chǎn)生中和抗體；內層的核蛋白抗原，可使體內產(chǎn)生補體結合抗體和沉淀素，無保護作用。從患者或患病動物體內分離的毒株成為自然毒株或街毒株（streetvirus），毒力強；經(jīng)過腦組織多次傳代后，成為固定毒株（fixedvirus），毒力弱，可以用于疫苗制備。目前二頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點病原學病毒主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、唾液腺和唾液內。在唾液腺、海馬角、大腦皮層細胞漿內形成嗜酸性包涵體，稱為Negribodies(NB)，是病毒復制和裝配的場所。病毒可以在大鼠、小鼠、家兔和雞胚等腦組織內增殖、致弱，也可以通過馴化，適應于非腦組織細胞。目前三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點狂犬病疫苗疫苗：所有用減毒或者殺死的病原生物（包括細菌、病毒、立克次氏體等）或其抗原性物質所制成，用于預防接種的生物制品。目的：預防、控制疾?。ㄈ缈袢。┑陌l(fā)生、流行。1881年法國巴斯德最早應用連續(xù)傳代減弱病毒毒力，成功制造出狂犬病疫苗。目前接種狂犬病疫苗是預防狂犬病唯一有效的手段。由于狂犬病幾乎100%的致死性，人用狂犬病疫苗必須是滅活苗。目前四頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點狂犬病疫苗的歷史經(jīng)歷五代疫苗神經(jīng)組織疫苗禽胚培養(yǎng)疫苗細胞培養(yǎng)疫苗亞單位及精致疫苗基因工程疫苗目前五頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點人用狂犬病疫苗生產(chǎn)流程細胞制備及培養(yǎng)接種毒株培育收獲病毒上清病毒純化病毒滅活原液檢定分裝及凍干目前六頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV的滅活病毒對H2O2、KMNO4、新潔爾液、來蘇兒、肥皂水、70%酒精、碘酒以及β-丙內酯敏感。目前通用β-丙內酯來滅活疫苗收獲液中的活毒，用量為1:4000，方法：4℃過夜，37℃水浴2h水解殘留的β-丙內酯。目前七頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點里程碑：分子生物學的誕生1962NobelprizeinPhysiologyorMedicine目前八頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點中心法則蛋白質目前九頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點原核生物和真核生物在基因表達上的區(qū)別目前十頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點什么是病毒？生物病毒是一類個體微小，結構簡單，只含單一核酸（DNA或RNA），必須在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型微生物。特點：不具細胞結構，具有遺傳、復制等生命特征，既無能能量代謝系統(tǒng)也無蛋白質和核酸合成系統(tǒng)……目前十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點病毒的形態(tài)⑴球狀病毒；⑵桿狀病毒；⑶磚形病毒；⑷冠狀病毒；⑸絲狀病毒；⑹鏈狀病毒；⑺有包膜的球狀病毒；⑻具有球狀頭部的病毒；⑼封于包含體內的昆蟲病毒等。病毒粒的對稱體制：病毒粒的對稱體制只有兩種，即⑴螺旋對稱（代表煙草花葉病毒）⑵二十面體對稱（等軸對稱，代表腺病毒）。一些結構較復雜的病毒，實質上是上述兩種對稱相結合的結果，故稱作復合對稱（代表T偶數(shù)噬菌體）。目前十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點目前十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點桿狀病毒HIV目前十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點絲狀病毒腺病毒目前十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點病毒的分類從遺傳物質分類：DNA病毒、RNA病毒、蛋白質病毒（如：朊病毒）。從病毒結構分類：真病毒（Euvirus，簡稱病毒）和亞病毒（Subvirus，包括類病毒、擬病毒、朊病毒）。從寄主類型分類：噬菌體（細菌病毒）、植物病毒（如煙草花葉病毒）、動物病毒（如禽流感病毒、天花病毒、HⅣ等）。從性質來分：溫和病毒（HⅣ）、烈性病毒（狂犬病病毒）。目前十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點病毒的分類國際病毒分類委員會（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses：ICTV）目前十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點目前十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點彈狀病毒科病毒結構示意圖目前十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點彈狀病毒科成員彈狀病毒科水泡性病毒屬狂犬病病毒屬?短暫熱病毒屬?細胞核彈狀病毒屬?非毒粒彈狀病毒屬?細胞質彈狀病毒屬?58種植物病毒未歸類植物病毒VSVRV目前二十頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點狂犬病病毒：Rabiesvirus,RV75

nm(60～85nm)180

nm

(60～400nm)目前二十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV基因組構成大小：約12kbp。單股負鏈RNA(-ssRNA)?；蚺挪迹?’to5’）：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（即依賴RNA的RNA聚合酶，L）。其中N基因最保守，常用于進化分析；G基因編碼的G蛋白是病毒唯一暴露在外表面的蛋白，是病毒的主要抗原，同時也是引起宿主免疫應答的主要組分。目前二十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點-ssRNAvs+ssRNA定義：一般來說根據(jù)RNA能否直接起mRNA作用而分成單股正鏈RNA病毒(正股RNA病毒)與單股負鏈RNA病毒(負股RNA病毒)兩種。RV屬于單股負鏈RNA病毒，即-ssRNA病毒。目前二十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV感染周期(CitedfromDietzscholdetal.,2005)目前二十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點逆軸突運輸機制(CitedfromDietzscholdetal.,2005)目前二十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點小結狂犬病病毒RV是彈狀病毒科(Rhabdoviridae

)狂犬病病毒屬(Lyssavirus

)的模式病毒種。RV呈子彈狀，長約為180

nm

(60-400nm)，直徑約為75

nm(60-85nm)。具有囊膜包被，基因組為12kbp大小的單股負鏈RNA(-ssRNA)。高度嗜神經(jīng)性，且逆軸突傳播。含有5個結構基因，從3’到5’依次為N、P、M、G和L。病毒粒子大?。?×105—8×105kDa，沉降系數(shù)為600S。目前二十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點根據(jù)N基因5’端500bp堿基的同源性分析，可以將狂犬病病毒屬分為7種基因型（Genotype，GT）：狂犬病病毒屬的分類GT病毒名稱縮寫I狂犬病病毒RVIILagos蝙蝠株LagVIIIMokola病毒MokVIVDuvenhage病毒DuvVV歐洲蝙蝠病毒-1EBL-1VI歐洲蝙蝠病毒-2EBL-2VII澳大利亞蝙蝠病毒ABL……….目前二十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點兩個遺傳譜系疫苗的交叉保護作用僅存在與同一個遺傳譜系內的病毒中！目前二十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點病毒感染的一般步驟吸附進入脫殼病毒基因轉錄和復制子代病毒裝配釋放目前二十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV感染的一般步驟目前三十頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV的復制和轉錄目前三十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV基因轉錄vs復制兩種狀態(tài)的RNA聚合酶：RNA轉錄酶和RNA復制酶。RNA轉錄酶：L、P、EF-1αβγ、Hsp60、GT（鳥苷轉移酶），從N基因處直接開始轉錄。RNA復制酶：L、P、可溶性的N蛋白（N-P復合物形式存在，為復制必須），從基因組的第一個bp處開始合成leaderRNA和復制基因組。目前三十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV基因的轉錄轉錄重要的順式作用元件：啟動子、轉錄起始位點和轉錄終止信號。RV基因轉錄調控模式：stop-startmodel。目前三十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV基因組僅有一個啟動子，5個基因有相同的轉錄起始位點：UUGU和轉錄終止信號：A/UCUUUUUUU。通用模式：-間隔區(qū)UUGU---ORF---A/UCUUUUUUU間隔區(qū)。RV轉錄元件目前三十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點Stop-startmodel一個基因轉錄的終止是下一個基因轉錄起始必須的。RNA聚合酶在終止上一個基因轉錄時，大約有30%的RNA聚合酶不能起始下游基因的轉錄，造成轉錄依次遞減30%。研究發(fā)現(xiàn)，-ssRNA基因表達的調控主要是通過基因與3’端啟動子的位置來控制的。目前三十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RV基因組的復制3’leader和5’trailer互補鏈均含有復制起始信號，但5’的trailer互補鏈的復制信號強度大于3’leader，造成-ssRNA：+ssRNA=50:1，因此包裝成熟的病毒粒子含有-ssRNA與含有+ssRNA的比例也約為50:1目前三十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點VSV轉錄和復制模型目前三十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點病毒粒子的裝配研究發(fā)現(xiàn)，RV的基因組兩端不存在特定的包裝信號，-ssRNA或+ssRNA包裝入病毒粒子完全由兩種RNA在細胞內的豐度決定(Finkeretal.,1997)。然而，對VSV的研究發(fā)現(xiàn)，VSV基因組-ssRNA

5’端的trailer區(qū)含有包裝信號，使-ssRNA被選擇性包裝入核衣殼(WhelanandWertz,1999)。目前三十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點G蛋白簡介狂犬病病毒G蛋白參與病毒的組織趨向性和致病性，是主要的保護性抗原，負責誘導病毒中和抗體的產(chǎn)生。

整個G蛋白分為四個結構域：信號肽(signalpeptite,SP)膜外區(qū)(ectodomain,ECTO)，跨膜區(qū)(transmembraneregion,TM)和膜內區(qū)(endodomain,ENDO)，成熟的G蛋白包括后面三個結構域。G全長:522-533aa成熟G蛋白:503-514aaSP:19aa,TM:22aa,ECTO:439aa,ENDO:42-53aa目前三十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點RVG蛋白主要抗原位點膜34-42198-200II膜外區(qū)：1-439aaI231IV264III330-357a342-343244-281G5跨膜區(qū)：440-460aa膜內區(qū)：462-505aa目前四十頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點反向遺傳學技術經(jīng)典遺傳學技術GregorJohannMendel1822-18841：1表型（phenotype）基因型（genotype）目前四十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點反向遺傳學技術表型（phenotype）基因型（genotype）基因重組技術目前四十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點-ssRNA反向遺傳學建立的基礎L、P、N和病毒-ssRNA或+ssRNA包裝形成核糖核蛋白復合體(ribonucleoprotein,RNP)。RNP負責病毒進入細胞后的所有復制過程，包括病毒基因的轉錄和基因組的復制等。體外構建具有活性的病毒單位必須提供：1.病毒-ssRNA或+ssRNA；2.L、P和N三種蛋白。目前四十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點病毒-ssRNA或+ssRNA的提供：提取病毒基因組反轉錄得到cDNA插入合適的載體轉入細胞，在外源提供RNA聚合酶的情況下轉錄出全