多糖的提取和純化

多糖的提取和純化目前，真菌多糖的提取可從子實體和采用深層培養(yǎng)發(fā)酵液的菌絲中分離獲得，但以從子實體中提取多糖為主。首先是將子實體粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加熱攪拌1一3小時除去表面脂肪。其次是用殘渣提取多糖，常用的方法有不同溫度下的水提法、稀酸提法、冷熱稀堿提法。水提法采用的較多，適合于提取水溶性多糖。稀酸提取法適用于提取酸溶性多糖、時間宜短，溫度不超過50r，以防止糖昔鍵斷裂。稀堿法適合于提取堿溶性糖。然后除去小分子雜質(zhì)，常采用透析法，將多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。第四步是沉淀多糖。大部分多糖在有機溶劑中的溶解度極小，所以可用有機溶劑來沉淀。常用4一5倍低級醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。最后是除去蛋白質(zhì)。除去多糖中的蛋白質(zhì)常用的方法是三氯醋酸法。得到的溶液基本上是沒有蛋白質(zhì)與小分子雜質(zhì)的多糖混合物或單一多糖。多糖的純化是將多糖混合物分離為單一的多糖。純化方法很多，主要純化方法有:(l)分步沉淀法根據(jù)不同多糖在不同濃度的低級醇或酮中具有不同溶解度的性質(zhì)，逐次按比例由小而大加入這些醇或酮分步沉淀。此法適用于分離各種溶解度相差較大的多糖。(2)鹽析法根據(jù)不同多糖在不同濃度鹽中具有不同溶解度而分離。純度鑒定和分子量測定多糖純度標(biāo)準(zhǔn)不能用通?；衔锛兌葮?biāo)準(zhǔn)來衡量，因為我們所說的多糖純品實質(zhì)上是一定分子量范圍內(nèi)的均一組成。因此，測得的分子量一般為平均分子量。過去常用粘度法、蒸氣壓滲透計法、沉降法、超速離心法、光散射法等測定高分子化合物分子量的方法測定真菌多糖的分子量，但由于這些方法測定起來比較麻煩，且誤差較大，現(xiàn)多數(shù)已不采用。目前實驗室常用的方法為凝膠過濾法和高壓液相色譜法，對于分子量小于1百萬的多糖用高壓液相法為最好。1.2.1發(fā)酵、提取取香菇465菌株斜面菌種接人搖瓶培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，逐級擴大培養(yǎng)至10O0L，25°C下通氣培養(yǎng)72h，壓濾，得香菇深層培養(yǎng)菌絲體。上述菌絲體經(jīng)水洗滌后，用3倍量熱水(90—100C)浸取3h，浸取液經(jīng)濃縮加3倍量95腸乙醇，離心得乙醇沉淀物一Le[''。1.2。2分離、純化取Le上樣于DEAE一纖維素柱上，用O。Olmol/LpH6.95Tris-HCI緩沖液洗脫，洗脫液分部收集，分別用UV(280nm)和酚硫酸法測定其吸收值(A值)，合并吸收峰重疊的洗脫液，經(jīng)濃縮、透析、凍干得淡黃色絮狀物L(fēng)e一2?Le一2進(jìn)一步用DEAE一纖維素(DE52型)分離，先用pH7.8的0.oosmol/L硼酸緩沖液洗脫，后用含lmol/LNaCI的o.Zmol/L硼酸緩沖液洗脫.各洗脫液按上法用UV230nm和酚硫酸法檢測，分別收集既含膚又含糖的洗脫液.用o.005mol/L硼酸緩沖液洗脫的組分為Le一2一1，用含lmol/LNaCI的硼酸緩沖液洗脫的組分稱Le一2一2o1.2.3鑒定1.2.3.1純度⑴HPLC法將樣品配成1%濃度后進(jìn)樣.進(jìn)樣量20召L。流動相:0.002mol/LNaAc;速:0.6ml/min。記錄色譜曲線和樣品保留時間(Tr)。(2)醋酸纖維薄膜電泳緩沖液:pH8.6巴比妥緩沖液.電壓12OV,25min.阿利新藍(lán)法染色.1?2?3.2分子量測定用T系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(T-40:44，400Da；T-70：85，000Da；T-110:110,000Da;T-500:450,000Da)上HPLC柱，測出保留時間后對分子量對數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線.然后根據(jù)樣品的保留時間，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出樣品分子量。1.2。3.3單糖組成⑴薄層層析將Le一2一1及Le-2一2分別用三氟醋酸在110°C下水解4h.蒸去三氟醋酸并蒸干，用3ml水溶解后點樣。層析板:醋酸纖維素層析板(DC—AufolienCelluloseF。);展開劑:正丁醇(BuOH):毗唆(Py):水(HZO)二6:4‘3;顯色劑:苯胺一鄰苯二甲酸.(2)氣相色譜取上述水解液加IOmgNaBHo在室溫下還原Zh,用冰醋酸調(diào)pH至5,減壓蒸干后加lml乙酸配，100C水浴lh,進(jìn)行乙酞化處理，將乙酸化產(chǎn)物的氯仿抽提液作氣相色譜分析，柱溫205C，氣化溫度250Co1‘3.1多糖的分離、純化將長裙竹蓀子實體干品洗凈、剪碎，用5倍的3%三氯乙酸溶液于5C提取8足離心，收集上清液，用4NNaOH溶液中和上清液至pH7,濃縮、離心，上清液加3倍體積的95%乙醇沉淀，收集沉淀物，冷凍干燥得粗多糖，得率約為8%.粗多糖含蛋白質(zhì)較多，采用蛋白酶法脫蛋白一次，Sevag法脫蛋白5次，去蛋白液經(jīng)透析，加3倍體積95%乙醇沉淀，水溶解，再醇析，反復(fù)三次得脫蛋白多糖。脫蛋白后的多糧2.0g)溶于水(1Oml)中，用DEAE一纖維素(Cl-)型柱(3.3X53cm)層析，用水作洗脫劑，分部收集，每管10ml，用硫酸一苯酚法測定多糖的分布。合并多糖單一峰位部分，減壓濃縮至5ml,再進(jìn)行一次DEAE一纖維素(B4O72-型)柱(1.8x50cm)層析，用水作洗脫劑.分部收集，用硫酸一苯酚法測定多糖分布.合并單峰洗脫液，濃縮至小體積，用SephadexG一200柱(2.OX5ocm)進(jìn)一步純化用o.05mol/1NaCI溶液作洗脫劑，用硫酸一苯酚法測定多糖分布，合并單峰洗脫液，透析去鹽，濃縮，再加3倍體積的95師乙醇沉淀，沉淀物經(jīng)冷凍干燥得到多糖，命名為DIAo1.3.2純度鑒定聚丙烯酞胺凝膠電泳按文獻(xiàn)方法進(jìn)行.阿利新藍(lán)染色。醋酸纖維薄膜電泳按文獻(xiàn)方法進(jìn)行，緩沖液為o.025mol/lpHg.0的硼砂緩沖液，紙scm，電壓160V，電泳50min，阿利新藍(lán)染色。凝膠過濾法采用Sepharose4B柱(79X1.6cm)進(jìn)行凝膠層析，用蒸餾水洗脫，硫酸一苯酚法隔管測定多糖的分布。紫外分光光度法采)JIUV一300進(jìn)行掃描(200—400nm)。觀察260nm、280nm處是否有吸收峰。根據(jù)上述測定結(jié)果，鑒定多糖的純化。1.3.3分子量測定采用Sepharose4B凝膠柱(79xl.6cm)層析，洗脫劑為蒸餾水，洗脫速度為3ml/8min，分部收集，用硫酸一苯酚法測定多糖的分布。再以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T一40(44.4Kd)、T一70(85Kd)、T一110(110Kd)和T一500(45Kd)分別重復(fù)上柱，測得各自的洗脫體積Ve，以LogM.W,對洗脫體積VO作圖得標(biāo)準(zhǔn)l山線。山多糖DIA的洗脫體積，查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，求得該多糖的分子量。1.3.5紙層析分析多糖DiA用2NH2SO4封管，100水解6h，水解液用BaC03中和、過濾、濃縮后點樣分析。采川新華中速層析濾紙，下行法。溶劑系統(tǒng)為醋酸乙酯:毗啶，水=10，4，3;顯色劑為苯胺一鄰苯二甲酸。干品洗凈剪碎一一5倍蒸餾水，98-100提取5h紗布粗濾，離心3000轉(zhuǎn)/分一一上清液適當(dāng)濃縮，加3倍95乙醇沉淀，離心3000轉(zhuǎn)/分一一沉淀凍干一一粗多糖蛋白酶法和sevag法脫蛋白脫蛋白多糖SephadexA-25柱層析，先用0.1mol/LNaCl洗至無糖檢出，再用0.1-3.9mol/LNaCl梯度洗脫——含糖部分SephadexG-200柱層析0.1mol/LNaCl洗脫——多糖純品Sevag法(即氯仿與正丁醇的比例為3:1)脫蛋白，振搖0.5h左右,使樣品中蛋白質(zhì)與混合液形成凝膠，再反復(fù)多次用離心法除去。1多糖研究概述1.1多糖提取：多糖多為水溶性多糖，組分不溶于高濃度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有機溶劑。多糖的提取一般分三步進(jìn)行。浸提：一般采用冷水或溫水浸提。浸提一段時間后，加乙醇或丙酮深淀，離心分離沉淀。用乙醇或乙醚脫水，最后真空干燥或冷凍干燥后得粗多糖。脫蛋白：用喪Sevag法(即氯仿與正丁醇的比例為3:1)脫蛋白，振搖0.5h左右，使樣品中蛋白質(zhì)與混合液形成凝膠，再反復(fù)多次用離心法除去。也可用三氯醋酸法，三氟三氯乙烷脫蛋白。純化：多糖純化多采用柱層所。脫蛋白后的多糖用水溶解后，用DEVE纖維素柱層析，然后依次用不同濃度的NavSUB>2v/SUB>COvSUB>3v/SUB>，NaOH洗脫。此外，純化還可采取凝膠柱層析法，超濾法等。1.2多糖分子量的測定：所謂多糖純品實質(zhì)上是一定分子量范圍內(nèi)的均一組分，因此測定的多糖分子量為平均值。以前多采用蒸氣壓滲透計法、沉降法、超速離心法、光散射法等測定高分子化合物分子量，但由于這些方法測定起來比較麻煩，且誤差很大。目前常用的方法為凝膠過濾法和高壓液相色譜法，對于分子量小于一百萬的多糖，用高壓液相法為最好。1.3多糖結(jié)構(gòu)的確定：多糖的活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，但確定多糖的細(xì)微結(jié)構(gòu)是很難的，原因是分級純化難關(guān)，從自然界分離的粗多糖是非常復(fù)雜的大混合物，包括生物大分子混合；不同多糖（中性多糖、酸性多糖或雜多糖）的混合；同種多糖大小分子的混合，必須采取適合特點的方法分離分級純化，否則不易確定其結(jié)構(gòu)。從同一樣品采用不同分級方法，常有不同結(jié)果。植物的不同部位，因功能不同，其中的多糖也是各色各樣的，必須分開來研究。比如人參的根、莖、葉、果中的多糖，雖都含有中性雜多糖、酸性雜多糖組分，其組成與結(jié)構(gòu)都是不同的。在人參莖、葉、果的中性雜多糖、酸性雜多糖組成中都有葡萄糖，而根的中性雜多糖、酸性雜多糖組成中都沒有葡萄糖，而只有以葡萄糖為主鏈的類淀粉多糖儲存在根部。多糖結(jié)構(gòu)確定有化學(xué)降解法、酶降解法、免疫化學(xué)法、放射化學(xué)法、紅外光譜法、核磁共振法、氣相層析法、質(zhì)譜法、質(zhì)譜與氣相層聯(lián)用、高效液相色譜法等，要完成對多糖整體結(jié)構(gòu)的分析，必須將各種方法結(jié)合起來。多糖的結(jié)構(gòu)研究，還不能忽視金屬離子的貢獻(xiàn)，多糖鏈中含烴基、乙?；?、氨基、硫酸基等易與多種金屬離子形成絡(luò)合物。多糖在自然環(huán)境中是否與金屬離子有關(guān)系，如何才會是其最佳狀態(tài)，也是應(yīng)考慮的。金屬離子的加入或可能是多糖的活性中心的成員，金屬離子的存在因絡(luò)合多糖鏈而會影響構(gòu)象變化。多糖的結(jié)構(gòu)確定與生物活性測試后，研究者的進(jìn)一步是研究其構(gòu)象、大分子間相互影響、活性中心、金屬離子影響以及化學(xué)修飾的研究，從不則角度來闡明結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。2.1工藝流程銀耳孢子發(fā)酵粉一熱水煮提一冷卻離心一沉淀加一定濃度NaOH液攪拌，離心―上清液-3V乙醇沉析一多糖沉淀一多糖粗品一蒸餾水加熱溶解一冷卻離心一上清液—Sevag法除蛋白―離心取上清液—減壓濃縮—蒸餾水透析—透析袋內(nèi)容液—3V乙醇沉析多糖T沉淀T真空干燥T精制多糖T離子交換層析（DEAE-32-Cellu-lose）—洗脫液—減壓濃縮—3V乙醇沉析多糖—沉淀—銀耳堿提取多糖—離子交換層析純化（DEAE-32-Cellulose）—洗脫液—減壓濃縮—3V乙醇沉析多糖—沉淀干燥—均一體銀耳堿提取多糖。2.2.1水提取取300g銀耳孢子發(fā)酵粉（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物扶研究所藥廠提供），加入10倍量的水，煮提約4h。煮后放冷，將提取液離心（15min，4000r/min）。提取后的殘渣加入約10倍的水，以相同的方法煮提2次并離心分離，收集沉淀。合并3次所得的上清液，濃縮至小體積后放置，另作它用。取少許沉淀，加入水?dāng)嚢枞芙夂箅x心（15min，4000r/min），用苯酚硫酸法檢測上清液反應(yīng)陰性。將所得沉淀于50°C烘箱中烘干，粗多糖重量為188.8g。2.2.2堿液提取取140g粗多糖，加入0.5mol/LNaOH1000ml，攪攔提取6h，離心15皿in，沉淀以相同的方法再提取2次，合并3次所得的提取液，沉淀另置。將提取液減壓濃縮至約原體積的1/3，以1mol/L的HCl中和至pH=7，中和液減壓濃縮至小體積。濃縮后的中和液用流動水透析3天。透析后的溶液用3V85%乙醇沉析，離心15min。收集沉淀，得到0.5mol/LNaOH提取的堿溶性多糖（62g）。0.5mol/LNaOH提取后的粗多糖，繼用1mol/LNaOH、2.5mol/LNaOH、5mol/LNaOH分別進(jìn)行提取，得到1mol/LNaOH（48g）、2.5mol/LNaOH（33g）、5mol/LNaOH（10g）提取物。將0.5mol/LNaOH提取物用約700ml水?dāng)嚢枞芙?，加?75mlSevag試劑（氯仿:正丁醇=4:1），機械攪拌0.5h，離心（15min，4000r/min）。反復(fù)用此法除蛋白，直至無蛋白質(zhì)反應(yīng)為止。將所得上清液減壓濃縮至小體積，流動水透析3天，透析袋內(nèi)溶液用3V85%乙醇沉析。抽濾，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥，得0.5mol/LNaOH提取精制多糖，稱重為4.470g。以相同的方法對上述1mol/LNaOH、2.5mol/LNaOH、5mol/LNaOH提取物除蛋白。除蛋白后的各提取物重量分別為3.908g、0.929g、0.399g。2.2.3分離、純化（1）分離[7?10]:取600mg0.5mol/LNaOH提取所得精制多糖加入10ml蒸餾水，使之充分溶解，抽濾，取濾液。將濾液加于已經(jīng)預(yù)處理的DEAE-32-纖維素層析柱，用0.1MNaCl溶液洗脫，流速為0.5ml/min，每10ml為1個單位分部收集，苯酚-硫酸法檢測。合并單一洗脫峰濃縮至小體積，以流動水透析。透析液加入3V85%乙醇沉析。抽濾，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥，多糖重量為148mg。以相同的方法分別對1mol/LNaOH（348mg）、2.5mol/LNaOH（558mg）、5mol/LNaOH提取物（399mg）進(jìn)行DEAE-32-纖維素柱層析，分別得到單一洗脫峰°1M，2.5M，5M提取物分別得多糖113mg，180mg，157mg。（2）純化:用（1）相同的方法分別對0.5M、1M、2.5M、5M提取物所得多糖用DEAE-32-cellulose柱層析純化，洗脫液為0.1MNaCl，苯酚-硫酸法檢測。所得多糖純品重量分別為TFFB-A11