轉(zhuǎn)基因生物資料

轉(zhuǎn)基因生物資料第1頁(yè)/共98頁(yè)基因:是一個(gè)特定的DNA片段，編碼一種特定的多肽或蛋白質(zhì)，是遺傳信息的功能單位第2頁(yè)/共98頁(yè)一般說來，從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的全部生命有機(jī)體，它們的基因都是由DNA構(gòu)成的。由于所有生物的DNA的基本結(jié)構(gòu)是一致的，因此，來自兩種生命形態(tài)的基因可以融為一體。由此可見，基因的DNA共性，是進(jìn)行基因工程的重要理論基礎(chǔ)之一。第3頁(yè)/共98頁(yè)DNA分子是遺傳物質(zhì)和基因的載體?；蚴羌?xì)胞中所有的RNA及蛋白質(zhì)分子的“藍(lán)圖”。一旦基因發(fā)生突變，那么由它指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)也將隨之發(fā)生變化，甚至可能導(dǎo)致活性的喪失。第4頁(yè)/共98頁(yè)1）轉(zhuǎn)基因：將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中。2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenetechnology）：指利用分子生物學(xué)技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其它物種中，改造生物的遺傳物質(zhì)，并使其在性狀、營(yíng)養(yǎng)和消費(fèi)品質(zhì)等方面向人類需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。第5頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)自然選擇人工定向改造第6頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)

將希望轉(zhuǎn)入的基因注射到小鼠的受精卵的細(xì)胞核中，使注射的DNA整合到受精卵的基因組中。然后將該卵細(xì)胞注射（移植）到宿主鼠的子宮中，使其發(fā)育，產(chǎn)下子代小鼠，從子代鼠中提取DNA樣品，檢測(cè)外源基因（轉(zhuǎn)移基因）是否整合到了子代鼠中。成功移植不成功移植探針檢測(cè)到轉(zhuǎn)移基因?qū)⒆⑸渫庠椿虻穆岩浦驳剿拗魇笞訉m中向受精卵中注射外源基因第7頁(yè)/共98頁(yè)

通常都是將提取的DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后電泳，將電泳后凝膠上的核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)移到薄膜（硝酸纖維素薄膜）上，用探針檢測(cè)是否存在轉(zhuǎn)移基因。探針是能夠與轉(zhuǎn)移基因結(jié)合的一段單鏈DNA或RNA。

著名的轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)是讓小鼠攜帶額外的生長(zhǎng)激素基因，結(jié)果接受了外源生長(zhǎng)激素基因的受精卵發(fā)育的小鼠的體重是正常小鼠體重的兩倍。

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利用蘇云金芽孢桿菌在西紅柿細(xì)胞DNA內(nèi)引入一段基因，這段基因能夠編碼出對(duì)毛毛蟲有毒性的蛋白，抑制蟲害。

抗毛毛蟲西紅柿正常鼠轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)激素基因的小鼠第9頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因微生物：分解石油的假單孢桿菌等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：轉(zhuǎn)基因牛、豬、雞、鯉魚等

轉(zhuǎn)基因植物：轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因抗除草劑農(nóng)作物等第10頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因植物第11頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：以實(shí)驗(yàn)方法將外源基因?qū)雱?dòng)物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特點(diǎn)分子及細(xì)胞水平操作，組織及動(dòng)物整體水平表達(dá)第12頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究歷史▲1974年，美國(guó)學(xué)者Jaenisch首次應(yīng)用顯微鏡注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠?！?981年，美國(guó)科學(xué)家成功地將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。第13頁(yè)/共98頁(yè)▲1982年，Palmiter將大鼠的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫阎?，獲得體重是對(duì)照組2倍的“超級(jí)鼠”?！?/p>

1985年，Wagner等利用拼接有新霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），獲得嵌合體小鼠，為利用ES細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因小鼠開辟了先河。第14頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠1982年，英國(guó)的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個(gè)美國(guó)實(shí)驗(yàn)小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長(zhǎng)激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?，培育出具快速生長(zhǎng)效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長(zhǎng)速度快2～3倍，體積大一倍。第15頁(yè)/共98頁(yè)▲1989年，意大利學(xué)者用精子作為載體轉(zhuǎn)移目的基因，成功地獲得了純系轉(zhuǎn)基因小鼠?！?987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國(guó)著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α-抗胰蛋白酶，含量高達(dá)30毫克/升。▲1997年2月，英國(guó)羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細(xì)胞克隆羊“多利”培育成功。第16頁(yè)/共98頁(yè)▲1999年2月，上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀闭Q生，其體內(nèi)被檢測(cè)到帶有人的血清白蛋白基因，這項(xiàng)成果被評(píng)為當(dāng)年“中國(guó)十大科技進(jìn)展”之一?！?997年10月，英國(guó)羅斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只攜帶有人凝血因子Ⅸ基因轉(zhuǎn)染綿羊。

第17頁(yè)/共98頁(yè)二、基本原理獲取外源目的基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中目的基因整合到基因組中再植入受體動(dòng)物輸卵管(子宮)

揭示外源基因的功能顯微注射等基因轉(zhuǎn)移方法發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育優(yōu)良的動(dòng)物品種第18頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作的具體流程（一）目的基因的設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因可分為隨機(jī)整合型基因和基因敲除（geneknockout）型載體基因。隨機(jī)整合型基因要求結(jié)構(gòu)完整，包括5’上游啟動(dòng)子區(qū)和3’下游區(qū)等，多用基因組文庫(kù)篩選或人為改造基因，改造基因可選擇不同的啟動(dòng)子來控制外源基因表達(dá)的組織特異性?；蚯贸╣eneknockout）型載體基因要設(shè)計(jì)與待剔除基因的同源性的載體基因。三、轉(zhuǎn)基因的基本方法第19頁(yè)/共98頁(yè)（二）重組載體的構(gòu)建

選擇合適的基因載體，要求載體序列不干擾外源基因的表達(dá)、能接受外源DNA、穩(wěn)定、對(duì)宿主細(xì)胞無威脅。（三）重組載體的體外驗(yàn)證（invitro）

重組載體的正確性驗(yàn)證，如拷貝數(shù)、連接方向等。對(duì)于連有組織特異性啟動(dòng)子或局部體細(xì)胞轉(zhuǎn)染的載體需先在同類型的體外離體培養(yǎng)細(xì)胞中初步驗(yàn)證表達(dá)特性。第20頁(yè)/共98頁(yè)（四）基因轉(zhuǎn)移1）化學(xué)法2）物理法3）生物法（五）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的驗(yàn)證從基因組、mRNA、蛋白質(zhì)和整體表型各個(gè)層次進(jìn)行驗(yàn)證。用核酸雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、免疫印跡雜交、酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法和Western雜交法等多種方法，篩選出有外源基因整合的陽(yáng)性動(dòng)物，傳代后檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)情況，對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性和生化性質(zhì)進(jìn)行鑒定，以及檢查轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理功能和是否出現(xiàn)某些疾病癥狀的表型等。第21頁(yè)/共98頁(yè)（六）組建轉(zhuǎn)基因系

第一代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是半合子轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，因?yàn)橥庠椿騼H在一條染色體上穩(wěn)定整合。只有通過選種選配，將兩個(gè)半合子轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成功交配，才能得到純合子轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物家系，外源DNA才能在后代中穩(wěn)定遺傳。

第22頁(yè)/共98頁(yè)1、顯微注射法：以單細(xì)胞受精卵為靶細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的外源DNA直接注射到受精卵的原核內(nèi)，再把接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管，使之發(fā)育成正常的幼仔，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體。目前應(yīng)用較廣泛，最早最經(jīng)典的方法。

操作技術(shù)性很強(qiáng)，受過嚴(yán)格訓(xùn)練的專業(yè)人員操作，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的受精卵也只占注射卵的5％。因此用增大微注射受精卵的數(shù)目的辦法提高成功率。轉(zhuǎn)基因的主要技術(shù)第23頁(yè)/共98頁(yè)第24頁(yè)/共98頁(yè)

1）顯微注射法microinjection

它是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效途徑。第25頁(yè)/共98頁(yè)第26頁(yè)/共98頁(yè)microinjection第27頁(yè)/共98頁(yè)第28頁(yè)/共98頁(yè)顯微注射法將外源基因?qū)肷臣?xì)胞和體系胞后，在染色體上的整合位置是隨機(jī)的外源基因甲基化程度在胚胎發(fā)育過程中會(huì)影響其活性某些外源基因的表達(dá)程度可受到個(gè)體細(xì)胞正常調(diào)節(jié)機(jī)制的控制由于受到宿主組織分化的影響，外源基因還具有一定的組織特異性第29頁(yè)/共98頁(yè)顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因鼠的成活率第30頁(yè)/共98頁(yè)優(yōu)點(diǎn)：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；導(dǎo)入過程直觀；無需載體缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多對(duì)操作人員有較高的技術(shù)要求效率低（尤其是大家畜）對(duì)卵子傷害大，胚胎存活率低轉(zhuǎn)基因沉默第31頁(yè)/共98頁(yè)2、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法▲ES細(xì)胞是早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細(xì)胞系?！且环N含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。可以在體外進(jìn)行人工培養(yǎng)，擴(kuò)增，并能以克隆的形式保存。第32頁(yè)/共98頁(yè)將攜帶有外源基因的ES細(xì)胞注射入動(dòng)物的早期胚胎內(nèi)，將來出生的動(dòng)物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因。再通過雜交繁育得到純合目的基因的個(gè)體，即為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動(dòng)物上應(yīng)用較晚。第33頁(yè)/共98頁(yè)第34頁(yè)/共98頁(yè)第35頁(yè)/共98頁(yè)

優(yōu)點(diǎn)：1.外源基因整合情況的可控性高,可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性2.外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，如逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、電擊法等，細(xì)胞鑒定及篩選方便

缺點(diǎn)：

1.ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難

2.維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易第36頁(yè)/共98頁(yè)

將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前后的胚胎（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)以達(dá)到感染目的),獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。目前這種方法主要應(yīng)用于雞胚胎操作。

3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法第37頁(yè)/共98頁(yè)反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的載體的構(gòu)建提取病毒未整合的環(huán)狀形式DNA；將環(huán)狀DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；選擇適當(dāng)?shù)拿笇⒉《窘Y(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)切除；將外源目的基因克隆到載體中第38頁(yè)/共98頁(yè)通過物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理：寄生在受體細(xì)胞中的重組病毒由于沒有包裝信號(hào)，能生產(chǎn)病病毒RNA和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒顆粒；病毒載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，載體上的包裝信號(hào)將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。第39頁(yè)/共98頁(yè)第40頁(yè)/共98頁(yè)第41頁(yè)/共98頁(yè)

優(yōu)點(diǎn)：

受精卵攜帶外源基因的陽(yáng)性率高外源基因多單拷貝整合操作簡(jiǎn)單，避免注射法對(duì)卵子的損害宿主范圍廣可同時(shí)感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高

缺點(diǎn)：

容納大小有限潛在致癌性,載體復(fù)雜整合率不高,胚胎自我保護(hù)機(jī)制對(duì)其有抗性第42頁(yè)/共98頁(yè)第43頁(yè)/共98頁(yè)4、體細(xì)胞核移植方法：將外源基因?qū)氲襟w細(xì)胞中，篩選、培養(yǎng)、擴(kuò)增，用這種細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植，即把體細(xì)胞核植入一個(gè)去了核的卵母細(xì)胞中，融合并激活，將重構(gòu)胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動(dòng)物的輸卵管。第44頁(yè)/共98頁(yè)第45頁(yè)/共98頁(yè)1997年2月17日英國(guó)Roslin研究所的Wilmut從1只六歲母羊的乳腺上皮細(xì)胞成功的克隆到了一只綿羊一多利(Dolly)。這是人類第一次采用分化的體細(xì)胞作為供體細(xì)胞，它的成功是20世紀(jì)生物學(xué)重大突破之一。學(xué)術(shù)意義在于證明分化的體細(xì)胞甚至是分化終端的體細(xì)胞核仍有全能性。第46頁(yè)/共98頁(yè)

優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因效率顯著超過顯微注射可以方便的建立生產(chǎn)畜群可以預(yù)測(cè)基因表達(dá)水平可以使用定點(diǎn)整合目標(biāo)基因的技術(shù)對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因改造后，用于核移植可以提高轉(zhuǎn)基因的效率，具有“ES細(xì)胞途徑”的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，且物種適用面廣。缺點(diǎn)：

技術(shù)上難度大，成功率極低，胚胎死亡率高，非一般實(shí)驗(yàn)室可以開展。第47頁(yè)/共98頁(yè)

直接以精子為載體的轉(zhuǎn)基因方法：將成熟精子與外源ＤＮＡ共培養(yǎng)，成熟精子與外源DNA預(yù)培養(yǎng)之后使精子有能力攜帶外源DNA進(jìn)入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色體中。

目前國(guó)際上只有1例成功模型，國(guó)內(nèi)也很少有相關(guān)報(bào)道，精子載體法很少被應(yīng)用。

5、精子載體法第48頁(yè)/共98頁(yè)第49頁(yè)/共98頁(yè)染色體及基因水平：斑點(diǎn)雜交、Southern雜交、PCR轉(zhuǎn)錄水平：Northern雜交蛋白質(zhì)水平：Western印跡轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因的檢測(cè)第50頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究存在的問題第51頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的低效性轉(zhuǎn)入基因造成宿主基因突變問題轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)問題病毒轉(zhuǎn)基因研究存在的問題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型與預(yù)期不符問題乳腺生物反應(yīng)器的問題社會(huì)問題第52頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究出現(xiàn)的問題1、制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率低：如顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物小鼠、大鼠、兔、牛、豬、綿羊，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率分別為26%、44%、15%、0.7%、0.9%,0.9%。2、外源基因在宿主基因組中的行為難以控制：轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合于動(dòng)物基因組中，有可能引起宿主細(xì)胞染色體的插入突變，可造成插入位點(diǎn)的基因片段的丟失及位移，也可能激活正常情況下處于關(guān)閉的基因。其結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體出現(xiàn)不育、胚胎死亡、流產(chǎn)、畸形等異?，F(xiàn)象。3、轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低：許多轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平受到宿主染色體上整合位點(diǎn)的影響，出現(xiàn)異位表達(dá)，影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)能力，從而使大部分轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平較低第53頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用第54頁(yè)/共98頁(yè)一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用研究基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因的組織特異性表達(dá)研究發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控克隆在發(fā)育中起重要作用的基因基因多級(jí)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究細(xì)胞功能研究第55頁(yè)/共98頁(yè)基因敲除（geneknockout），是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分——觀察整體——推測(cè)功能的三部曲思想相似。

第56頁(yè)/共98頁(yè)基因敲除的技術(shù)路線如下：

（1）構(gòu)建重組基因載體﹔

（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)﹔

（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞﹔

（4）將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。第57頁(yè)/共98頁(yè)二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用研究病毒性疾病研究建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與基因治療生產(chǎn)天然活性藥物蛋白第58頁(yè)/共98頁(yè)1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是對(duì)多種生命現(xiàn)象本質(zhì)深入了解的工具。如研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、細(xì)胞發(fā)育的潛能性、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系、胚胎發(fā)育調(diào)控、腫瘤、神經(jīng)與發(fā)育等。第59頁(yè)/共98頁(yè)2、可用來建立多種疾病的動(dòng)物模型，進(jìn)而研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理及治療方法。如代謝病高歇氏(Gaucher)病轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用。第60頁(yè)/共98頁(yè)3、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)可由于改造動(dòng)物的基因組而改良其經(jīng)濟(jì)性狀，提高經(jīng)濟(jì)效益。第61頁(yè)/共98頁(yè)4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器。如轉(zhuǎn)基因山羊抗凝血酶III、轉(zhuǎn)基因綿羊1-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)基因兔的-葡萄糖苷酶。第62頁(yè)/共98頁(yè)5、通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以生產(chǎn)人體或動(dòng)物進(jìn)行器官或組織移植時(shí)所需的器官和組織。如家畜胎兒神經(jīng)細(xì)胞可替代人類神經(jīng)細(xì)胞用于帕金森癥的治療。第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院將轉(zhuǎn)基因乳豬皮用于皮膚移植。豬器官的體積和形狀以及DNA基本與人類相似，是理想的腎、心、肝等器官供應(yīng)者，但存在免疫排斥，可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和克隆技術(shù)培育大量不含免疫排斥的轉(zhuǎn)基因克隆豬的器官。第63頁(yè)/共98頁(yè)乳腺生物反應(yīng)器的研究

1987年，Gordon首次報(bào)道小鼠乳腺中表達(dá)tPA蛋白。至今國(guó)際上轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)基因牛等的成功報(bào)道實(shí)例已有10多種，生產(chǎn)出抗胰蛋白酶、乳鐵蛋白、人凝血蛋白因子Ⅷ、蛋白質(zhì)C等藥用蛋白。國(guó)外經(jīng)濟(jì)學(xué)家預(yù)期，10年后，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥物銷售額超過250億美元。第64頁(yè)/共98頁(yè)基因藥物生產(chǎn)基因藥物生產(chǎn)第一階段是細(xì)菌基因工程，第二階段是動(dòng)物細(xì)胞基因工程，第三階段是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物—乳腺生物反應(yīng)器。第65頁(yè)/共98頁(yè)三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究進(jìn)展1、英格蘭羅斯林研究所(Roslin)1997年成功培育轉(zhuǎn)基因綿羊，其乳汁中含有人的凝血因子IX，用來治療血友??；含有的-抗胰蛋白酶可治療北美肺氣腫。第66頁(yè)/共98頁(yè)2、日本培育的轉(zhuǎn)基因雞含有白血病阻止因子，可能成為生產(chǎn)抗癌藥品的“動(dòng)物工廠”。3、湖北省農(nóng)科院魏慶信研究員2000年培育轉(zhuǎn)基因豬，能合成人血清白蛋白，為治療因失血、創(chuàng)傷、癌癥等引起的休克、水腫等提供醫(yī)用血清白蛋白開辟了新途徑。4、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)合作，用轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)人瘦蛋白的研究。第67頁(yè)/共98頁(yè)5、用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)的基因工程小鼠已經(jīng)達(dá)到很高的水平。如將特定的外源基因插入小鼠的基因組，可得到轉(zhuǎn)基因小鼠(transgenicmice)；將小鼠的基因組中特定內(nèi)源基因定點(diǎn)突變，可得到基因剔除小鼠(geneknockoutmice)；將小鼠的基因組中特定內(nèi)源基因進(jìn)行定向重組，可得到基因替換小鼠(geneknockinmice)。為醫(yī)學(xué)研究提供了豐富的動(dòng)物模型。如BALB/C-HSF1用于熱休克研究、Smad3用于研究粘膜免疫缺陷和骨性關(guān)節(jié)炎等。第68頁(yè)/共98頁(yè)6、轉(zhuǎn)基因研究已經(jīng)滲透到醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、畜牧學(xué)等領(lǐng)域。第69頁(yè)/共98頁(yè)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用前景

1、研究外源基因在動(dòng)物整體水平的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型可用來進(jìn)行疾病發(fā)病學(xué)和治療性研究3、改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，提高動(dòng)物育種效率。4、改變動(dòng)物基因使其表現(xiàn)型更適合人類需要，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)一些人類所需的生物活性物質(zhì)。第70頁(yè)/共98頁(yè)第二節(jié)轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物(transgenicplant)：是指利用重組DNA技術(shù)將克隆的優(yōu)良目的基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織中進(jìn)行表達(dá)，從而獲得新性狀的植物。這一技術(shù)使基因交流的范圍無限擴(kuò)大，可將從細(xì)菌、病毒、動(dòng)物、遠(yuǎn)緣植物、人工合成的基因?qū)胫参?，所以其?yīng)用前景十分廣闊第71頁(yè)/共98頁(yè)一、基本方法獲取外源目的基因，克隆到表達(dá)載體培養(yǎng)受體細(xì)胞，如培養(yǎng)懸浮細(xì)胞將轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)培養(yǎng)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)基因植株的鑒定電擊法、基因槍法、顯微注射法培植陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株抗蟲基因第72頁(yè)/共98頁(yè)第73頁(yè)/共98頁(yè)1.技術(shù)路線目的基因分離植物表達(dá)載體的構(gòu)建受體材料的準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化組織組織脫分化轉(zhuǎn)化植株篩選煉苗第74頁(yè)/共98頁(yè)

1.目的基因的分離（1）已知基因的獲得①化學(xué)合成法②PCR擴(kuò)增（2）未知基因的獲得①構(gòu)建基因組文庫(kù)，篩選目的基因②構(gòu)建cDNA文庫(kù)，篩選目的基因③mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因④差異蛋白質(zhì)譜表達(dá)技術(shù)篩選功能基因……第75頁(yè)/共98頁(yè)①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①銀杏葉RNA提?、诜崔D(zhuǎn)錄cDNA③全長(zhǎng)cDNA的克?、芸寺〖皽y(cè)序⑤兩端引入酶切位點(diǎn)⑥雙酶切⑦定向克?、鄬?dǎo)入農(nóng)桿菌

2.植物表達(dá)載體的構(gòu)建第76頁(yè)/共98頁(yè)例pBI121-chs構(gòu)建pBI121圖譜第77頁(yè)/共98頁(yè)

3.遺傳轉(zhuǎn)化（1）間接轉(zhuǎn)化法——農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（2）直接轉(zhuǎn)化法

A、基因槍轉(zhuǎn)化法

B、電擊法

C、花粉管通道法

D、PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法第78頁(yè)/共98頁(yè)根癌農(nóng)桿菌

(Agrobacteriumtumefaciens),是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,它含有Ti質(zhì)粒,能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成腫瘤,即誘發(fā)冠癭瘤.Ti質(zhì)粒(包括Ri質(zhì)粒)上有一段轉(zhuǎn)移DNA,在農(nóng)桿菌侵染宿主植物時(shí),這段DNA可以轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞,并穩(wěn)定地保留在植物細(xì)胞染色體中,變?yōu)橹参锛?xì)胞新增加的一群基因,最終能通過有性世代遺傳給子代。第79頁(yè)/共98頁(yè)基因槍轉(zhuǎn)化法由美國(guó)Cornell大學(xué)的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢?；蚪鹆?表面,通過高壓驅(qū)動(dòng)力加速微粒穿透植物細(xì)胞壁,導(dǎo)入受體組織細(xì)胞內(nèi),然后通過組織培養(yǎng)再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后,整合到染色體上并得到表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。第80頁(yè)/共98頁(yè)電擊法的主要原理是將原生質(zhì)體在溶液中與DNA混合,然后利用高壓電脈沖作用,使原生質(zhì)體膜的某些部位被擊穿而產(chǎn)生可回復(fù)的小孔,外源DNA可通過小孔進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi),而且不影響經(jīng)電擊處理的原生質(zhì)體再生植物的能力.第81頁(yè)/共98頁(yè)花粉管通道法是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道,直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜?xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化.第82頁(yè)/共98頁(yè)P(yáng)EG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子。PEG可促使細(xì)胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細(xì)胞間的識(shí)別,利于細(xì)胞膜間的融合以及外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體.第83頁(yè)/共98頁(yè)表1幾種植物轉(zhuǎn)基因方法比較

轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)化的缺點(diǎn)DNA間接轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移受體種類，可以在原生質(zhì)體、蛋細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)、組織器官或整株等多級(jí)水平上進(jìn)行，方法成熟可靠，簡(jiǎn)便易行，周期短，轉(zhuǎn)化率高；轉(zhuǎn)化雙子葉植物為主。大多數(shù)單子葉植物和裸子植物對(duì)農(nóng)桿菌的侵入不敏感，限制了該法在禾谷類作物中的應(yīng)用。轉(zhuǎn)化體常出現(xiàn)“嵌合”現(xiàn)象，需在嚴(yán)格條件下加以選擇以淘汰未轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA直接轉(zhuǎn)化法1）基因槍轉(zhuǎn)化法2）電擊法3）PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法4）花粉管通道法無宿主限制，適用于各種單、雙子葉植物，操作簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)化效率低，需要專門設(shè)備（電擊儀、顯微操作儀或基因槍），多數(shù)需要原生質(zhì)體與愈傷組織，周期太長(zhǎng)（電擊法）第84頁(yè)/共98頁(yè)

4.轉(zhuǎn)化組織——農(nóng)桿菌介導(dǎo)之葉盤轉(zhuǎn)化法帶有轉(zhuǎn)化基因的農(nóng)桿菌活化受體植物葉盤侵染共培養(yǎng)篩選培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗預(yù)培養(yǎng)葉盤，或愈傷組織第85頁(yè)/共98頁(yè)5.煉苗第86頁(yè)/共98頁(yè)6.轉(zhuǎn)基因苗的篩選與鑒定培養(yǎng)過程中利用標(biāo)記基因篩選標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因(Slectivegene)報(bào)告基因(Reportgene)抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物安全性標(biāo)記類選擇基因……β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)熒光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Cat)綠色熒光蛋白基因(Gfp)……第87頁(yè)/共98頁(yè)例Gus檢測(cè)原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催化β－葡萄糖苷酯類物質(zhì)水解。其中很多水解產(chǎn)