第五課蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測(cè)定

第一節(jié)N端分析原理一、耦聯(lián)蛋白質(zhì)和多肽的自由α—氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑耦聯(lián)后，與其緊鄰的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。目前一頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)二、裂解在無(wú)水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個(gè)殘基。緊挨的第二個(gè)氨基酸殘基暴露出自由的α—氨基，又可與PITC進(jìn)行耦聯(lián)反應(yīng)。目前二頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)三、轉(zhuǎn)化

ATZ—氨基酸不穩(wěn)定，在三氟乙酸水溶液(25％)中可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH—氨基酸。目前三頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前四頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)四、PTH—氨基酸的鑒定可以通過(guò)薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。近年來(lái)由于高效液相色譜技術(shù)具有分析速度快、靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且儀器自身結(jié)構(gòu)也日臻完善，被廣泛應(yīng)用于PTH—氨基酸的鑒定。通常選用C—18反相柱進(jìn)行分離。目前五頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)第二節(jié)N端蛋白質(zhì)序列儀三、氣相序列儀自動(dòng)化蛋白質(zhì)序列儀剛問(wèn)世時(shí)，需要樣品量為1～2mg。1978年Tarr等將一種四級(jí)銨鹽聚合物“polybrene”引入了蛋白質(zhì)、多肽的序列測(cè)定，它能和肽鏈中的極性基團(tuán)作用(非共價(jià)鍵合)而將蛋白質(zhì)和多肽有效地固定在玻璃纖維支持膜上，防止了萃取時(shí)樣品的損失。為了適應(yīng)分子生物學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)微量分析的要求，20世紀(jì)80年代初，Hewick及Hunkpillar等人改進(jìn)了自動(dòng)化蛋白質(zhì)序列儀中的儀器結(jié)構(gòu)，它用彈筒型玻璃反應(yīng)室(內(nèi)部體積約0.05m1)代替了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用polybrene固定樣品，Edamn降解反應(yīng)中有的試劑如三甲胺以氣體方式輸送，其他試劑以流動(dòng)或液相脈沖方式輸送。此儀器較之以前幾種序列儀具有以下明顯優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需50～100pmol；②試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的l／10，降低了費(fèi)用；③縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率。

20世紀(jì)80年代末又對(duì)氣相序列儀進(jìn)行了部分改進(jìn)，即將原來(lái)三氟乙酸以氣體方式輸送改為液相脈沖方式，稱為脈沖液相序列儀，以適應(yīng)不同樣品的分析需要。另外，由于載有活性基團(tuán)的功能性PVDF膜的問(wèn)世，蛋白質(zhì)和多肽可以共價(jià)固定在此類膜上，直接在上述兩種序列儀上進(jìn)行固相序列分析。目前六頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)

在這兩種序列儀中，Edman降解后的PTH—氨基酸衍生物可及時(shí)直接從轉(zhuǎn)化腔中自動(dòng)輸入高效液相色譜儀中進(jìn)行PTH—氨基酸衍生物的定性及定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺(tái)儀器統(tǒng)一用電腦控制，包括化學(xué)反應(yīng)和分析鑒定以及數(shù)據(jù)的自動(dòng)記錄和處理。圖4.2為標(biāo)準(zhǔn)PTH—氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在20min內(nèi)將各組分較好分離，需選擇合適的色譜條件，表4.1列出了各種條件的改變導(dǎo)致個(gè)別組分位置的遷移及圖譜的改善。目前七頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前八頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)第三節(jié)影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素在測(cè)序中往往可以發(fā)現(xiàn)，即使N端很均一的蛋白質(zhì)(第一個(gè)循環(huán)出現(xiàn)單個(gè)氨基酸殘基)，經(jīng)過(guò)十幾個(gè)循環(huán)后背景明顯不及第一個(gè)殘基清晰。這是由于Edman反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過(guò)程，在其耦聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。目前最佳產(chǎn)率為95％～98％。因此，經(jīng)過(guò)50次循環(huán)后，PTH—氨基酸分析譜中將出現(xiàn)較多雜峰，影響正確辨認(rèn)，也就是說(shuō)對(duì)于一般蛋白質(zhì)最多能分析至N端第50個(gè)氨基酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質(zhì)降解成一系列肽段分析后再拼接。①對(duì)于有些蛋白質(zhì)由于含有較多的對(duì)Edman反應(yīng)敏感的殘基或肽鍵，裂解效率將更低。②循環(huán)至Ser和Thr時(shí)產(chǎn)率突然降低，這是因?yàn)樵谶M(jìn)行這兩個(gè)氨基酸殘基分析前一個(gè)循環(huán)中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與Ser和Thr上的羥基反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和Thr的N端—氨基。③另外，絲氨酸和蘇氨酸的PTI-{{汀生物也會(huì)部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率的降低。

耦聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生下列副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。測(cè)序完成后，電腦將每個(gè)循環(huán)的產(chǎn)率處理，得出起始產(chǎn)率(initialyield)和重復(fù)產(chǎn)率(repetitiveyield)，其中通過(guò)起始產(chǎn)率可以估計(jì)蛋白質(zhì)的真實(shí)含量，有時(shí)可以推測(cè)N端是否封閉(和氨基酸組成分析測(cè)得的含量相差甚遠(yuǎn))，而重復(fù)產(chǎn)率則表明機(jī)器是否正常運(yùn)轉(zhuǎn)。另外，如果蛋白質(zhì)或多肽中含有過(guò)多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸殘基，也將降低這兩個(gè)數(shù)值。目前九頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)第六節(jié)C端序列分析

雖然建立在Edman化學(xué)法上的自動(dòng)化N端測(cè)序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問(wèn)題需借助C端序列分析來(lái)解決。C端測(cè)序尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達(dá)的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制、N端封閉蛋白的分析以及DNA探針的設(shè)計(jì)。由于選擇性對(duì)C端羧基進(jìn)行耦聯(lián)修飾并從C端逐一將氨基酸殘基切下較N端測(cè)序困難，在過(guò)去的近20年里，雖然為數(shù)不少的蛋白質(zhì)化學(xué)家致力于C端測(cè)序研究，但目前仍不能和N端測(cè)序技術(shù)程度媲美。蛋白質(zhì)化學(xué)工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對(duì)個(gè)別氨基酸殘基有選擇性，使用時(shí)仍有一定困難。最近，由于對(duì)化學(xué)法測(cè)定C端技術(shù)進(jìn)行了一系列改進(jìn)，已有了自動(dòng)化C端序列儀問(wèn)世。所以介紹一種自動(dòng)化C端測(cè)序方法的原理及應(yīng)用。目前十頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)一、C端分析原理基于與N端Edman降解類似的原理，C端分析采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的α—羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的C端衍生物被切割下來(lái)，通過(guò)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。一個(gè)完整的C端序列分析包括以下幾個(gè)步驟：(1)活化蛋白質(zhì)和多肽C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，并進(jìn)一步環(huán)化成嗯唑酮，而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐難以成環(huán)。C端的嗯唑酮在硫氰四丁銨的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲(thiohydantoin，TH)。目前十一頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)(2)酰胺化保護(hù)側(cè)鏈羧基側(cè)鏈羧基形成混合酸酐后，與硫氰哌啶進(jìn)一步作用形成酰胺，以保護(hù)側(cè)鏈。目前十二頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)(3)烷基化由于C端環(huán)化形成的TH衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，因此產(chǎn)率不高。用溴甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。目前十三頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)(4)修飾Thr和Ser的羥基蛋白質(zhì)和多肽中的羥基會(huì)干擾測(cè)序，因此需要修飾。在活化過(guò)程中，乙酸酐也會(huì)與羥基反應(yīng)將其乙?；?，但反應(yīng)不完全，在N—甲基咪唑(NMl)和乙酸酐的共同作用下，Thr和Ser上的羥基基本被乙酰化。目前十四頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)(5)裂解和衍生

C端的ATH衍生物在酸性條件下與[NCS]—反應(yīng)而被裂解生成ATH—氨基酸，新的C端自動(dòng)形成TH，而不必重新活化。因此，整個(gè)測(cè)序過(guò)程只需在開始時(shí)對(duì)C端進(jìn)行一次性活化，并修飾Asp和Glu側(cè)鏈羧基以及The和Ser的羥基。實(shí)際上，循環(huán)反應(yīng)的只有烷基化和裂解兩步，其全過(guò)程圖解如下圖。目前十五頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)二、C端蛋白質(zhì)序列儀近年來(lái)，已有商品化的C端序列儀問(wèn)世。C端序列儀一般由N端序列儀改裝而成，其基本結(jié)構(gòu)與后者相似，兩者的不同之處主要在于：①反應(yīng)所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵塞管道；②在C端序列儀中，所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中進(jìn)行，切割下來(lái)的ATH—AA僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶解后即進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分離分析；而在N端測(cè)序儀中，ATZ—AA需在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為PTH-AA。目前十六頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前十七頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)

四、影響C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素

C端測(cè)序副反應(yīng)較多，最高初始產(chǎn)率僅為20％，而對(duì)于Glu，Asp，Ser，Thr等氨基酸，其產(chǎn)率將更低。如C端富含上述幾種氨基酸，測(cè)序?qū)⑹掷щy。另外，一旦遇到Pro，由于吡咯環(huán)的存在而不能與乙酸酐反應(yīng)成環(huán)，整個(gè)測(cè)序過(guò)程將終止。到目前為止，C端測(cè)序可測(cè)1～10個(gè)殘基，一次測(cè)序需要的量比N端測(cè)序要大得多，至少需1nmol。此外，因?yàn)椴煌陌被岱磻?yīng)產(chǎn)率不同，所以，對(duì)圖譜的分析也比N端測(cè)序復(fù)雜，需要較多的經(jīng)驗(yàn)。目前C端測(cè)序結(jié)果最好的一個(gè)樣品是馬肌紅蛋白原，可測(cè)C端10個(gè)以上殘基，通常將其作為標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)判斷儀器的穩(wěn)定性。另外，由于副反應(yīng)的存在，有的氨基酸將生成不止一種ATH衍生物。如Arg的ATH衍生物可能被乙?；蛲榛?；Tyr-ATH可被乙?；?；Cys被修飾后將形成丙烯酰胺化的Cys-ATH以及脫氫Ala-ATH；脫水Thr-ATH將產(chǎn)生兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體。

目前十八頁(yè)\總數(shù)十九頁(yè)\編于十六點(diǎn)五、結(jié)語(yǔ)和展望目前，C端序列測(cè)序技術(shù)已初步成熟，并開始發(fā)揮作用。但其反應(yīng)的效率與N端Edman降解測(cè)序法有一定的差距。因此，目前的主要問(wèn)題是如何提高反應(yīng)的產(chǎn)率，特別是如何改善T，S，D，E幾種氨基酸的測(cè)定