第8章高效液相色譜法

一、液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph2023/4/30目前一頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點液相色譜儀（2）2023/4/30目前二頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點液相色譜儀（3）2023/4/30目前三頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點液相色譜儀（4）2023/4/30目前四頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點二、高效液相色譜法的特點

featureofHPLC

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2023/4/30目前五頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點三、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程2023/4/30目前六頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點2.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性（動畫）2023/4/30目前七頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2023/4/30目前八頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點(3)進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2023/4/30目前九頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點(4)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2023/4/30目前十頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點(5)液相色譜檢測器

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。特點：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；

對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2023/4/30目前十一頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點第八章

高效液相色譜法一、液-固吸附色譜liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatograph三、離子交換色譜ion-exchange

chromatograph四、離子色譜ionchromatograph五、離子對色譜ion-pairchromatograph六、排阻色譜size-exclusionchromatograph七、親和色譜(AC)Affinity

chromatograph第二節(jié)

主要分離類型與原理highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2023/4/30目前十二頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點一、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2023/4/30目前十三頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點二、液-液分配色譜

liquid-liquidpartition

chromatography固定相與流動相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；

流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2023/4/30目前十四頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點三、離子交換色譜

ion-exchange

chromatography

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2023/4/30目前十五頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點四、離子色譜

ionchromatography

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。有關(guān)內(nèi)容將在第十章第六節(jié)中講授。2023/4/30目前十六頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點五、離子對色譜

ionpairchromatography

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；

反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+

X-后；在兩相間分配。2023/4/30目前十七頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點第八章

液相色譜法一、液相色譜固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色譜流動相

mobilephaseofHPLC第三節(jié)

液相色譜的固定相與流動相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseandmobilephaseofHPLC2023/4/30目前十八頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點一、液相色譜固定相

stationaryphasesofLC

1.液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；2023/4/30目前十九頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/4/30目前二十頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

2023/4/30目前二十一頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點2.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

2023/4/30目前二十二頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點3.離子交換色譜分離固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）2023/4/30目前二十三頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點4.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2023/4/30目前二十四頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點二、液相色譜的流動相

mobilephasesofLC1.流動相特性

（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2023/4/30目前二十五頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點2.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2023/4/30目前二十六頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點3.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/4/30目前二十七頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點4.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。2023/4/30目前二十八頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點第十章

液相色譜法一、影響分離的因素factorsinfluencedseparation二、分離類型的選擇choiceofseparationtypes三、液相色譜的應(yīng)用applicationofHPLC四、液相制備色譜preparativeliquidchromatography第四節(jié)

影響分離的因素與操作條件的選擇highperformanceliquidchromatograph

factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition2023/4/30目前二十九頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點一、影響分離的因素

factorsinfluencedseparation1.影響分離的因素與提高柱效的途徑

在高效液相色譜中,液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，即：

H=A+Cu故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。2023/4/30目前三十頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。2023/4/30目前三十一頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點2.流速流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。

3.固定相及分離柱

氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。2023/4/30目前三十二頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點二、分離類型選擇

choiceofseparationtypes2023/4/30目前三十三頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點三、HPLC的應(yīng)用

applicationofHPLC

1.環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器：差示折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進行分析。2023/4/30目前三十四頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器2023/4/30目前三十五頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點四、制備型液相色譜

preparativeliquidchromatography

獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。半制備柱（內(nèi)徑8mm，長度15～30cm），一次制備量０.1～１mg；1.色譜柱的柱容量（柱負荷）對分析柱：不影響柱效時的最大進樣量；

對制備柱：不影響收集物純度時的最大進樣量；

超載：進樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。

超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。2023/4/30目前三十六頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點2.液相制備色譜的方法收集組分時，通常有以下情況：

（1）可獲得良好分離，主峰使用制備柱，超載提高效率；（2）兩主成分之間的小組分；超載，分離切分使待分離組分成為主成分（富集）后，再次分離制備。

2023/4/30目前三十七頁\總數(shù)四十三頁\編于十三點3.制備型液相色譜

制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。

制備柱：內(nèi)徑20～50mm，柱長50cm。2023/4/30目