第二章熒光和化學發(fā)光分析法

第二章熒光和化學發(fā)光分析法第1頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*第2頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*Stokes用分光計觀察到：熒光的波長比入射光的波長稍微長些五顏六色雨后路面上水珠油膜呈現(xiàn)第3頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*

基態(tài)分子吸收能量(電能、熱能、化學能或光能等)，電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，以發(fā)射電磁輻射(即光)的形式釋放能量。

分子發(fā)光：分子+電能化學能光能生物活性參與化學發(fā)光

電致發(fā)光化學發(fā)光光致發(fā)光生物發(fā)光熒光磷光第4頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*分子發(fā)光：光致發(fā)光：光第5頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2.1熒光分析法2.1.1熒光分析法基本概念2.1.2熒光強度及影響因素2.1.3儀器裝置2.1.4定量分析方法2.1.5熒光分析測定方法、特點和應用第6頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*A分子的激發(fā)態(tài)————分子激發(fā)態(tài)和三線激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)：基態(tài)分子吸收能量后，價層電子躍遷到高能級的分子軌道上稱為電子激發(fā)態(tài)

。是分子的亞穩(wěn)定狀態(tài)。基態(tài)：

在正常狀態(tài)下，分子處于最低能級的分子軌道上稱為基態(tài)。是分子的穩(wěn)定狀態(tài)。2.1.1熒光分析法基本概念2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第7頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*

電子自旋多重度

電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，分子中的電子可以處在不同的自旋狀態(tài),常用電子自旋多重度來描述。M=2S+1S是電子的總自旋量子數(shù)，各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和。2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第8頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*

單重態(tài)（M=1）：電子自旋都配對的分子的電子態(tài)稱為單重態(tài)，用“S”表示。

三重態(tài)（M=3）：分子中的電子對的電子自旋平行的電子態(tài)稱為三重態(tài)，用“T”表示。S2>T2>S1>T1>S0

(洪特規(guī)則)

M=2S+1M自旋多重度S總自旋量子數(shù)2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第9頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2023/5/3S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫分子熒光和磷光發(fā)射過程第10頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和非輻射躍遷(熱)等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換系間跨越振動弛豫非輻射躍遷延遲熒光外轉(zhuǎn)換返回速度快的途徑，發(fā)生幾率大!B分子去激發(fā)過程及熒光的產(chǎn)生2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第11頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*e（1）.

振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動時間10-11~10-13s。1、非輻射躍遷2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第12頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*e（2）.

內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重度的電子能級中,

相等能級間的非輻射能級交換。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時間10-12s。2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第13頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*e（3）.系間跨越：不同多重態(tài)在有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。電子自旋改變，躍遷禁阻，通過自旋-軌道耦合等躍遷。2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第14頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*（4）.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而損失能量回到基態(tài)的非輻射躍遷。

外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第15頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*（1）.

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)各振動能級，發(fā)射時間約為10-7～10-9s。

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長。

e2、輻射躍遷2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第16頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*（2）.

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)各振動能級。發(fā)光時間：10-4～10s。eS0

→激發(fā)態(tài)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)換→系間跨越→振動弛豫→

T1

→S0

2.1.1.1熒光及其產(chǎn)生第17頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*1、熒光激發(fā)光譜

固定熒光測量波長，改變激發(fā)光的波長，測量不同波長λex激發(fā)光照射下熒光強度的變化，記錄熒光強度F與激發(fā)光波長的關(guān)系曲線。2.1.1.2熒光激發(fā)光譜曲線和發(fā)射光譜曲線第18頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2、熒光發(fā)射光譜

固定激發(fā)光波長和強度，記錄在不同波長λem下所發(fā)射的熒光強度所得關(guān)系曲線即不同波長下熒光強度的分布。發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。2.1.1.2熒光激發(fā)光譜曲線和發(fā)射光譜曲線第19頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*

熒光發(fā)射光譜與吸收光譜成鏡像關(guān)系

2.1.1.2熒光激發(fā)光譜曲線和發(fā)射光譜曲線

吸收光譜的形狀表明了分子第一激發(fā)單重態(tài)的振動能級；發(fā)射光譜表明分子基態(tài)的振動能級結(jié)構(gòu)。

基態(tài)與激發(fā)態(tài)兩者的振動能級結(jié)構(gòu)相似，激發(fā)與去激發(fā)組成相反的兩個過程。S03210S13210第20頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*

分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件1.

具有合適的結(jié)構(gòu)：通常是含有苯環(huán)和稠環(huán)的剛性結(jié)構(gòu)的有機分子；2.

具有一定的熒光量子產(chǎn)率。2.1.1.3熒光效率第21頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*Φ=發(fā)射熒光的分子數(shù)激發(fā)分子總數(shù)2.1.1.3熒光效率熒光量子產(chǎn)率（Φ）：

衡量熒光物質(zhì)發(fā)光能力。它表示激發(fā)分子發(fā)射出熒光(或磷光)

的比例。第22頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，可用各過程的速率常數(shù)來表示熒光量子產(chǎn)率：熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，取決于分子結(jié)構(gòu)。各種非輻射躍遷過程的速率常數(shù)之和。取決于分子所處的化學環(huán)境，同時也與化學結(jié)構(gòu)有關(guān)。2.1.1.3熒光效率第23頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*

熒光分子與其他分子相互作用引起熒光強度降低甚至熒光消失的現(xiàn)象為熒光猝滅，又稱熒光熄滅。（1）、碰撞猝滅---動態(tài)猝滅

M*+Q→M+Q+熱量激發(fā)態(tài)分子猝滅劑2.1.1.4猝滅第24頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*（2）、生成化合物的猝滅---靜態(tài)猝滅

M+Q→MQ

基態(tài)的熒光物質(zhì)與猝滅劑反應生成非熒光的化合物，導致熒光的猝滅。2.1.1.4猝滅（3）、能量轉(zhuǎn)移

M*+Q→M+

Q*

激發(fā)態(tài)的分子與猝滅劑作用，能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，猝滅劑被激發(fā)。第25頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*（5）、自猝滅

熒光物質(zhì)的濃度較大時，激發(fā)態(tài)分子之間碰撞較多，在碰撞中引起能量損失，產(chǎn)生自熄，使熒光強度減小。2.1.1.4猝滅（4）、氧的猝滅

氧對溶液熒光產(chǎn)生猝滅作用的原因比較復雜，可能包含著多種機理。

第26頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2.1.2熒光強度及影響因素2.1.2.1熒光強度與溶液濃度的關(guān)系2.1.2.2有機物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系2.1.2.3金屬離子螯合物的熒光2.1.2.4實驗條件對熒光強度的影響第27頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*Epsilon（大寫Ε，小寫ε），是第五個希臘字母。漢字讀音：艾普西龍朗伯-比爾定律P15第28頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*A躍遷的類型

n→π*εmax＜100平均壽命10-5~10-7s；π→π*εmax≥104

平均壽命10-7~10-8sπ*→π是有機化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型，具有π*→π共軛雙鍵的分子才能發(fā)射較強的熒光。2.1.2.2有機物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光的產(chǎn)生是分子先經(jīng)歷π→π*或n→π*激發(fā)，然后經(jīng)振動弛豫或其他非輻射躍遷再發(fā)生π*→π或π*→n而得到熒光。第29頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*B共軛效應

產(chǎn)生熒光的有機物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，熒光量子產(chǎn)率越高，向長波方向移動?；衔锪孔赢a(chǎn)率φF

λex（nm）λem（nm）苯萘蒽丁省2052863653902.1.2.2有機物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系0.110.280.360.52278321404480第30頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*C分子共平面效應芴Φ

=1聯(lián)苯Φ

=0.2熒光分子的共平面性增加，則共軛體系大，有利于π→π*

躍遷。2.1.2.2有機物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系第31頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*熒光黃Φ

=0.92酚酞Φ

=02.1.2.2有機物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系第32頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*D取代基效應1.

給電子取代基加強熒光-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN產(chǎn)生p→π共軛2.

吸電子取代基減弱熒光-C=O，-COOH，-NO2摩爾吸光系數(shù)小，熒光發(fā)射弱，系間跨躍較大，同樣使熒光減弱。

2.1.2.2有機物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系第33頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*D取代基效應2.1.2.2有機物的熒光與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系A(chǔ)躍遷的類型B共軛效應C分子共平面效應第34頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2.1.2.3金屬離子螯合物的熒光（2）螯合物中金屬離子的發(fā)光（1）螯合物中配位體的發(fā)光第35頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2.1.2.3金屬離子螯合物的熒光（1）螯合物中配位體的發(fā)光

不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會發(fā)生熒光。如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強的熒光。第36頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2.1.2.3金屬離子螯合物的熒光

這類發(fā)光過程通常是螯合物首先通過配位體的躍遷激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)給金屬離子，導致dd

躍遷和ff躍遷，最終發(fā)射的是dd躍遷和ff躍遷光譜。（2）螯合物中金屬離子的發(fā)光第37頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2、溶劑3、溶液黏度和溫度

4、溶液的PH值2.1.2.4實驗條件對熒光強度的影響1、激發(fā)光源第38頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2.1.2.4實驗條件對熒光強度的影響1、激發(fā)光源激發(fā)光強度I0大，熒光強度增大，靈敏度增高。2、溶劑

主要表現(xiàn)為溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成對化合物的熒光發(fā)生變化。

*→躍遷類型：溶劑極性增大，躍遷能量降低，發(fā)生紅移，熒光增強。氫鍵、配位鍵的形成主要影響熒光分子的存在型體、電離狀態(tài)，熒光強度和形狀均發(fā)生很大變化。第39頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*3、溶液黏度和溫度

黏度大，溫度低，可減小碰撞引起的熒光熄滅，熒光強度增大。溫度升高，外轉(zhuǎn)換的幾率增加，熒光強度降低。4、溶液的PH值不同PH值下，熒光分子存在形式不同。2.1.2.4實驗條件對熒光強度的影響第40頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2.1.3儀器裝置CaryEclipse熒光分光光度計熒光、磷光化學/生物發(fā)光美國瓦里安技術(shù)中國有限公司第41頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*一、熒光分光光度計結(jié)構(gòu)流程

2.1.3儀器裝置光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器、檢測器、顯示系統(tǒng)。特殊點：兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。第42頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*1、激發(fā)光源

汞燈、碘鎢燈、氙弧燈、激光等。2、樣品池

I0ItIf樣品池四面透光。2.1.3儀器裝置第43頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*4、檢測器

一般采用硒光電池。檢測器的方向與激發(fā)光的方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光的干擾。

3、單色器

激發(fā)單色器：選擇激發(fā)光波長，用以分離出所需用的激發(fā)光。發(fā)射單色器：選擇熒光發(fā)射波長，用以濾去雜散光、瑞利光、拉曼光和雜質(zhì)所發(fā)射的熒光。

2.1.3儀器裝置第44頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*二、磷光分光光度計結(jié)構(gòu)流程

光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器斬波器（磷光鏡）利用熒光和磷光發(fā)射壽命的差別通常情況下，樣品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，來測定低溫磷光。第45頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2、定量方法

1、定量依據(jù)

2.1.4定量分析方法第46頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*1、定量依據(jù)

熒光強度

If

正比于吸收的光強度

Ia和熒光量子產(chǎn)率Φ：由朗伯-比耳定律得：熒光強度If：2.1.4定量分析方法第47頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*對于稀溶液，當2.303bC<0.05時：

If

----熒光強度I0

----入射光強度Φf----熒光量子產(chǎn)率b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--物質(zhì)濃度2.1.4定量分析方法第48頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2、定量方法

標準曲線法：FCsFxCx2.1.4定量分析方法第49頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*A無機化合物的熒光分析如Mg、Al、Ca等，本身不發(fā)射熒光，但與有機試劑可形成熒光配合物進行定量測定；

直接法：如8-羥基喹啉與Al離子反應生成熒光配合物

安息香，水楊醛縮鄰氨基苯酚，黃酮醇，二苯乙醇酮

2.1.5熒光分析測定方法、特點和應用第50頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*熒光熄滅法第51頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*B有機化合物的熒光分析本身發(fā)射熒光的，如羅丹明B、熒光素等可直接測定；不發(fā)射熒光的物質(zhì)可經(jīng)過處理后成為發(fā)射熒光的物質(zhì)進行測定；第52頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*C：蛋白質(zhì)的熒光分析蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，有的氨基酸自身可以發(fā)熒光，例如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸第53頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*2.熒光胺和氨基反應生成具有熒光的產(chǎn)物3.鄰苯二甲醛（OPA）在一定的條件下可與伯胺、多胺生成具有熒光的產(chǎn)物第54頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三*D核酸檢測生命物質(zhì)常