第十章 吸光光度法

第十章吸光光度法第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三選擇顯色反應(yīng)的一般標(biāo)準(zhǔn)

:(1)選擇性要好。一種顯色劑最好只與一種被測組分起顯色反應(yīng)，這樣干擾就少?；蛘吒蓴_離子容易被消除、或者顯色劑與被測組分和干擾離子生成的有色化合物的吸收峰相隔較遠(yuǎn)。

(2)靈敏度要高。由于吸光光度法一般是測定微量組分的，靈敏度高的顯色反應(yīng)有利于微量組分酌測定。靈敏度的高低可從摩爾吸光系數(shù)值的大小來判斷，κ值大靈敏度高，否則靈敏度低。但應(yīng)注意，靈敏度高的顯色反應(yīng)，并不一定選擇性就好，對于高含量的組分不一定要選用靈敏度高的顯色反應(yīng)。(3)對比度要大。即如果顯色劑有顏色，則有色化合物與顯色劑的最大吸收波長的差別要大，一般要求在60nm以上。第31講第十章吸光光度法第2講第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

(4)有色化合物的組成要恒定,化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定。有色化合物的組成若不確定，測定的再現(xiàn)性就較差。有色化合物若易受空氣的氧化、日光的照射而分解，就會引入測量誤差。

(5)顯色反應(yīng)的條件要易于控制。如果條件要求過于嚴(yán)格，難以控制，測定結(jié)果的再現(xiàn)性就差。第31講第十章吸光光度法第2講第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三2.顯色劑(1)無機顯色劑許多無機試劑能與金屬離子起顯色反應(yīng)，如Cu2+與氨水形成深藍(lán)色的絡(luò)離子Cu(NH4)42+，SCN-與Fe3+形成紅色的絡(luò)合物Fe(SCN)2+或Fe(SCN)63-等。但是多數(shù)無機顯色劑的靈敏度和選擇性都不高，其中性能較好，目前還有實用價值的有硫氰酸鹽、鉬酸銨、氨水和過氧化氫等。(2)有機顯色劑許多有機試劑，在一定條件下，能與金屬離子生成有色的金屬螯合物(具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物)。第31講第十章吸光光度法第2講第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

將金屬螯合物應(yīng)用于光度分析中的優(yōu)點是：

1．大部分金屬螯合物都呈現(xiàn)鮮明的顏色，摩爾吸光系數(shù)大于104，因而測定的靈敏度很高；

2．金屬螯合物都很穩(wěn)定，一般離解常數(shù)都很小，而且能抗輻射；

3．專用性強，絕大多數(shù)有機整合劑，在一定條件下，只與少數(shù)或其一種金屬離子絡(luò)合，而且同一種有機螯合劑與不同的金屬離子絡(luò)合時，生成具有特征顏色的螯合物

第31講第十章吸光光度法第2講第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

4．雖然大部分金屬螯合物難溶于水，但可被萃取到有機溶劑中，大大發(fā)展了萃取光度法。

5．在顯色分子中，金屬所占的比率很低，提高了測定的靈敏度。因此，有機顯色劑是光度分析中應(yīng)用最多最廣的顯色劑，尋找高選擇性、高靈敏度的有機顯色劑，是光度分析發(fā)展和研究的重要內(nèi)容。第31講第十章吸光光度法第2講第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

在有機化合物分子中，凡是包含有共軛雙鍵的基團如—N＝N—、—N＝O、—NO2、對醌基、＝C＝O(羰基)、＝C＝S(硫羰基)等，一般都具有顏色，原因是這些基團中的л電子被光激發(fā)時，只需要較小的能量，能吸收波長大于200nm的光，因此，稱這些基團為生色團；某些含有未共用電子對的基團如胺基—NH2，RHN—，R2N—(具有一對未共用電子對)，羥基-OH(具有兩對末共用電子對)，以及鹵代基—F，—Cl，—Br，—I等，它們與生色基團上的不飽和鍵互相作用，引起永久性的電荷移動，從而減小了分子的活化能促使試劑對光的最大吸收“紅移”(向長波方向移動)，使試劑顏色加深，這些基團稱為助色團。第31講第十章吸光光度法第2講第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

含有生色基團的有機化合物常常能與許多全屬離子化合生成性質(zhì)穩(wěn)定且具有特征顏色的化合物，且靈敏度和選擇性都很高，這就為用光度法測定這些離子提供了很好的條件。有機顯色劑的種類很多，下面僅將應(yīng)用較廣泛的幾種介紹如下：

1.鄰二氮菲

2.雙硫腙

3.二甲酚橙

4.偶氮胂III5．鉻天青S第31講第十章吸光光度法第2講第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三（二）顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)能否完全滿足光度法的要求，除了與顯色劑的性質(zhì)有主要關(guān)系外，控制好顯色反應(yīng)的條件也是十分重要的，如果顯色條件不合適，將會影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。1.顯色劑的用量顯色就是將被測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物，表示：

M+R=MR(被測組分)(顯色劑)(有色化合物)

反應(yīng)在一定程度上是可逆的。為了減少反應(yīng)的可逆性，根據(jù)同離子效應(yīng)，加入過量的顯色劑是必要的，但也不能過量太多，否則會引起副反應(yīng)，對測定反而不利。第31講第十章吸光光度法第2講第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三2.溶液的酸度溶液酸度對顯色反應(yīng)的影響很大，這是由于溶液的酸度直接影響著金屬離子和顯色劑的存在形式以及有色絡(luò)合物的組成和穩(wěn)定性。因此，控制溶液適宜的酸度，是保證光度分析獲得良好結(jié)果的重要條件之一。

(1)酸度對被測物質(zhì)存在狀態(tài)的影響大部分高價金屬離子都容易水解，當(dāng)溶液的酸度降低時，會產(chǎn)生一系列羥基絡(luò)離子或多核羥基絡(luò)離子。高價金屬離子的水解象多元弱酸的電離一樣，是分級進行的。隨著水解的進行，同時還發(fā)生各種類型的聚合反應(yīng)。聚合度隨著時間增大，而最終將導(dǎo)致沉淀的生成。顯然，金屬離子的水解，對于顯色反應(yīng)的進行是不利的，故溶液的酸度不能太低。第31講第十章吸光光度法第2講第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

(2)酸度對顯色劑濃度和顏色的影響

光度分析中所用的大部分顯色劑都是有機弱酸。顯色反應(yīng)進行時，首先是有機弱酸發(fā)生離解，其次才是絡(luò)陰離子與金屬離子絡(luò)合。

M+HR＝MR+H+

從反應(yīng)式可以看出，溶液的酸度影響著顯色劑的離解,并影響著顯色反應(yīng)的完全程度。當(dāng)然，溶液酸度對顯色劑離解程度影響的大小，也與顯色劑的離解常數(shù)有關(guān)，Ka大時，允許的酸度可大；Ka很小時，允許的酸度就要小些。

第31講第十章吸光光度法第2講第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三許多顯色劑本身就是酸堿指示劑，當(dāng)溶液酸度改變時，顯色劑本身就有顏色變化。如果顯色劑在某一酸度時，絡(luò)合反應(yīng)和指示劑反應(yīng)同時發(fā)生，兩種顏色同時存在，就無法進行光度測定。例如、二甲酚橙在溶液的pH＞6.3時呈紅色，在pH＜6.3時呈檸檬黃色，在pH＝6.3時，呈中間色，故pH＝6.3時,是它的變色點。而二甲酚橙與金屬離子的絡(luò)合物卻呈現(xiàn)紅色。因此，二甲酚橙只有在pH＜6的酸性溶液中可作為金屬離子的顯色劑。如果在pH＞6的酸度下進行光度測定，就會引入很大誤差。

第31講第十章吸光光度法第2講第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

(3)對絡(luò)合物組成和顏色的影響對于某些逐級形成絡(luò)合物的顯色反應(yīng)、在不同的酸度時，生成不同絡(luò)合比的絡(luò)合物。例如鐵與水楊酸的絡(luò)合反應(yīng)，當(dāng)

pH＜4[Fe3+(C7H4O3)2-]+

紫色

4＜pH＜9[Fe3+(C7H4O3)22-]-

紅色

pH＞9[Fe3+(C7H4O3)32-]3-

黃色在這種情況下，必須控制合適的酸度，才可獲得好的分析結(jié)果。第31講第十章吸光光度法第2講第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

3.時間和溫度顯色反應(yīng)的速度有快有慢。顯色反應(yīng)速度，幾乎是瞬間即可完成，顯色很快達到穩(wěn)定狀態(tài)，并且能保持較長時間。大多數(shù)顯色反應(yīng)速度較慢，需要一定時間，溶液的顏色才能達到穩(wěn)定程度。有些有色化合物放置一段時間后，由于空氣的氧化，試劑的分解或揮發(fā)，光的照射等原因，使顏色減退。適宜的顯色時間和有色溶液穩(wěn)定程度，也必須通過實驗來確定。實驗方法是配制一份顯色溶液，從加入顯色劑計算時間、每隔幾分鐘測定一次吸光度，繪制A-t曲線，根據(jù)曲線來確定適宜的時間。第31講第十章吸光光度法第2講第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

不同的顯色反應(yīng)需要不同的溫度，一般顯色反應(yīng)可在室溫下完成。但是有些顯色反應(yīng)需要加熱至一定的溫度才能完成；也有些有色絡(luò)合物在較高溫度下容易分解。因此，應(yīng)根據(jù)不同的情況選擇適當(dāng)?shù)臏囟冗M行顯色。溫度對光的吸收及顏色的深淺也有一定的影響，故標(biāo)樣和試樣的顯色溫度應(yīng)保持一樣。合適顯色溫度也必須通過實驗確定,做A-c曲線即可求出。

4.有機溶劑和表面活性劑溶劑對顯色反應(yīng)的影響表現(xiàn)在下列幾方面。第31講第十章吸光光度法第2講

第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三（1）溶劑影響絡(luò)合物的離解度許多有色化合物在水中的離解度大，而在有機溶劑中的離解度小，如在Fe(SCN)3溶液中加入可與水混溶的有機試劑(如丙酮)，由于降低了Fe(SCN)3的離解度而使顏色加深提高了測定的靈酸度。（2）溶劑改變絡(luò)合物顏色的原因可能是各種溶劑分子的極性不同、介電常數(shù)不同，從而影響到絡(luò)合物的穩(wěn)定性，改變了絡(luò)合物分子內(nèi)部的狀態(tài)或者形成不同的溶劑化物的結(jié)果。（3）溶劑影響顯色反應(yīng)的速度例如，當(dāng)用氯代磺酚S測定Nb時，在水溶液中顯色需幾小時，如果加入丙酮后,僅需30分鐘。

表面活性劑的加入可以提高顯色反應(yīng)的靈敏度，增加有色化合物的穩(wěn)定性。其作用原理一方面是膠束增溶，另一方面是可形成含有表面活性劑的多元絡(luò)合物。第31講第十章吸光光度法第2講第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

5.共存離子的干擾及消除共存離子存在時對光度測定的影響有以下幾種類型：

(1)與試劑生成有色絡(luò)合物。如用硅鉬藍(lán)光度法測定鋼中硅時，磷也能與鉬酸銨生成絡(luò)合物，同時被還原為鉬藍(lán)，使結(jié)果偏高。

(2)干擾離子本身有顏色。如Co2+(紅色)、Cr3+(綠色)、Cu2+(藍(lán)色)。

(3)與試劑結(jié)合成無色絡(luò)合物消耗大量試劑而使被測離子絡(luò)合不完全。如用水揚酸測Fe3+時，Al3+、Cu2+等有影響。

(4)與被測離子結(jié)合成離解度小的另一化合物。如由于F-的存在，能與Fe3+以FeF63-形式存在，F(xiàn)e(SCN)3本不會生成，因而無法進行測定。第31講第十章吸光光度法第2講第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

消除干擾的方法主要有以下三種：（1）控制酸度控制顯色溶液的酸度，是消除干擾的簡便而重要的方法。許多顯色劑是有機弱酸，控制溶液的酸度，就可以控制顯色劑R的濃度，這樣就可以使某種金屬離子顯色，使另外一些金屬離子不能生成有色絡(luò)合物。當(dāng)溶液的情況比較復(fù)雜，或各種常數(shù)值不知道隊則溶液最適合的pH值須通過實驗方法來確定。第31講第十章吸光光度法第2講第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三（2）加入掩蔽劑在顯色溶液里加一種能與干擾離子反應(yīng)生成無色絡(luò)合物的試劑，也是消除干擾的有效而常用的方法。例如用硫氰酸鹽作顯色劑測定Co2+，F(xiàn)e3+有干優(yōu)可加入氟化物，使Fe3+與F-結(jié)合生成無色而穩(wěn)定的FeF63-，就可以消除干擾。在另外的情況下，也可通過氧化—還原反應(yīng)，改變干擾離子的價態(tài)以消除于擾。（3）采用萃取光度法用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑萃取有色組分,如用丁二酮肟測定鈀時，鈀與丁二酮肟所形成的內(nèi)絡(luò)鹽，可被氯仿從酸性溶液中選擇性地萃取。許多干擾離子則不被萃取。第31講第十章吸光光度法第2講第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三（4）在不同波長下測定兩種顯色配合物的吸光度,對它們進行同時測定。（5）尋找新的顯色反應(yīng)

如將二元配合物改變?yōu)槿浜衔?。?）分離干擾離子在沒有適當(dāng)掩蔽劑時，干擾離于可用電解法，淀法或離子交換法等分離除去。此外，還可以通過選擇適當(dāng)?shù)臏y量條件，消除干擾離子的影響。第31講第十章吸光光度法第2講第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三二、吸光光度法的測量誤差及測量條件的選擇

光度分析法的誤差來源有兩方面，一方面是各種化學(xué)因素所引入的誤差，另一方面是儀器精度不夠，測量不準(zhǔn)所引入的誤差。（一）儀器測量誤差任何光度計都有一定的測量誤差。儀器測量誤差主要是指光源的發(fā)光強度不穩(wěn)定，光電效應(yīng)的非線性，電位計的非線性、雜散光的影響、濾光片或單色器的質(zhì)量差(譜帶過寬)，比色皿的透光率不一致，透光率與吸光度的標(biāo)尺不準(zhǔn)等因素。對給定的光度計來說，透光率或吸光度的讀數(shù)的準(zhǔn)確度是儀器精度的主要指標(biāo)之一，也是衡量測定結(jié)果準(zhǔn)確度的重要因素。第31講第十章吸光光度法第2講第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第31講第十章吸光光度法第2講

光度計主要儀器測量誤差是表頭透射比的讀數(shù)誤差。光度計的讀數(shù)標(biāo)尺上透射比T的刻度是均勻的，故透射比的讀數(shù)誤差ΔT（絕對誤差）與T本身的大小無關(guān)，對于一臺給定儀器它基本上是常數(shù)，一般大0.002-0.01之間，僅與儀器身身的精度有關(guān)。第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三（二）測量條件的選擇選擇適當(dāng)?shù)臏y量條件，是獲得準(zhǔn)確測定結(jié)果的重要途徑。擇適合的測量條件，可從下列幾個方面考慮。

1.測量波長的選擇由于有色物質(zhì)對光有選擇性吸收，為了使測定結(jié)果有較高的靈鍍度和準(zhǔn)確度，必須選擇溶液最大吸收波長的入射光。如果有干擾時，則選用靈敏度較低但能避兔干擾的入射光，就能獲得滿意的測定結(jié)果。第31講第十章吸光光度法第2講第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

2.吸光度范圍的控制吸光度在0.15-0.80時，測量的準(zhǔn)確度較高。為此可以從下列幾方面想辦法：（1）計算而且控制試樣的稱出量，含量高時，少取樣，或稀釋試液；含量低時，可多取樣，或萃取富集。（2）如果溶液已顯色，則可通過改變比色皿的厚度來調(diào)節(jié)吸光度大小。第31講第十章吸光光度法第2講第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

3.參比溶液的選擇參比溶液是用來調(diào)節(jié)儀器工作零點的，若參比溶液選得不適當(dāng)，則對測量讀數(shù)準(zhǔn)確度的影響較大。選擇的辦法是：（1）當(dāng)試液、試劑、顯色劑均無色時，可用蒸餾水作參比液。（2）試劑和顯色劑均無色時，而樣品溶液中其他離子有色時，應(yīng)采用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。（3）試劑和顯色劑均有顏色時，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，然后把顯色劑、試劑均按操作手續(xù)加入，以此做參比溶液，這樣可以消除一些共存組分的干擾。第31講第十章吸光光度法第2講第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三此外，對于比色皿的厚度、透光率、儀器波長，讀數(shù)刻度等應(yīng)進行校正，對比色皿放置位置、光電池的靈敏度等也應(yīng)注意檢查。第五節(jié)吸光光度法的應(yīng)用

吸光光度法除了廣泛地用于測定微量成分外，也能用于常量組分及多組分的測定。同時，還可以用于研究化學(xué)平衡、絡(luò)合物組成的測定等。下面簡要地介紹有關(guān)這些方面的應(yīng)用。一、定量分析（一）單組分的測定第31講第十章吸光光度法第2講第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三1.一般方法

A-c標(biāo)準(zhǔn)曲線法2.示差法當(dāng)被測組分含量高時，常常偏離朗伯-比耳定律。即使不偏離，由于吸光度太大，也超出了準(zhǔn)確讀數(shù)的范圍，就是把分析誤差控制在5%以下，對高含量成分也是不符合要求的。如果采用示差法，就能克服這一缺點，也能使測定誤差降到±0.5％以下。示差法與普通光度法的主要區(qū)別在于它采用的參比溶液不同，它不是以c=0的試劑空白作參比，而是以一個濃度比試液cx稍小的標(biāo)準(zhǔn)溶液cs作參比，然后再測定試液的吸光度。第31講第十章吸光光度法第2講第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

As=-lgTs=κbcs

Ax=-lgTx=κbcx

實際測得吸光度Af為

Af=Ax-As=κb(cx-cs)=κbΔc

cx=cs+Δc

示差法相對普通光度法提高測量準(zhǔn)確度的原因是擴展了讀數(shù)標(biāo)尺。從儀器構(gòu)造上講，示差光度法需要一個發(fā)射強度較大的光源，才能將高濃度參比溶液的吸光度調(diào)至零，因此必須采用專門設(shè)計的示差分光光度計。第31講第十章吸光光度法第2講第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第31講第十章吸光光度法第2講

(二)多組分的同時測定同時測定一種試樣中的多種組分的基礎(chǔ)是吸光度具有加合性，即總吸光度為各個組分吸光度的總和。第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三二、絡(luò)合物組成和酸堿離解常數(shù)的測定（一）絡(luò)合物組成的測定

1.摩爾比法應(yīng)用分光光度法可以測定絡(luò)合物的組成(絡(luò)合比)和穩(wěn)定常數(shù)。這里簡要介紹一下用摩爾比法測定絡(luò)合物的絡(luò)合比。設(shè)絡(luò)合反應(yīng)為M+nR＝MRn

通常是固定金屬離子M的濃度，逐漸增加絡(luò)合劑的濃度。配位體為R，顯然，R應(yīng)是無色的或在選定的波長范圍內(nèi)無顯著吸收。然后稀釋至同一體積，得到[R]／[M]為1，2，3……的一系列溶液，配制相應(yīng)的試劑空白，在一定波長下，測定其吸光度，繪制曲線，用作圖法求得絡(luò)合比。第31講第十章吸光光度法第2講第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三

曲線前部分表示，絡(luò)合劑R濃度不斷增加，生成的絡(luò)合物不斷增多，吸光度逐漸增大。當(dāng)金屬離子M全部形成絡(luò)合物后，絡(luò)合劑R的濃度再增加，吸光度達到最大值而不再變化。曲線峰部分轉(zhuǎn)折不明銳、是由于絡(luò)合物有微小離解造成的。曲線峰兩線，交于D點，由D點向橫軸作垂線，交于橫軸的一點，這點的比值就是絡(luò)合物的配合化。第31講第十章吸光光度法