2023年版植物生理學實驗指導書

1120XX農學院[自編教材指導書]《植物生理學》試驗指導〔20XX〕XX葛秀秀楊明峰王文平趙筱萌編農學院生物科學與工程學院20XX.2名目★★★試驗室特別提示試驗一質壁分別法測定細胞滲透勢(4)試驗二小液流法測定植物組織水勢(5)試驗三葉綠體色素的提取分別理化性質及定量測定(7)試驗四植物根系活力的測定〔TTC法〕(10)試驗五過氧化氫酶〔CT〕活性的測定(12)試驗六植物硝酸復原酶〔NR〕活性的測定(14)試驗七植物細胞膜透性的測定(16)試驗八植物光合速率的測定(17)一、試驗室紀律要求依據規(guī)定，穿好試驗服進入試驗室。不同意將食品和飲用水帶進試驗室。XX試驗課中制止大聲喧嘩、跑動和打鬧。二、試驗安全留意事項留意電源使用安全，制止?jié)袷职尾宀孱^。水浴鍋鍋蓋開啟關閉時，留意幸免蒸汽燙傷。留意抽氣泵安全使用。留意使用分光光度計時參比液體樣品不能滿溢灑漏。三、試驗課程要求提前預習試驗指導內容，生疏試驗原理和步驟。檢查XX清洗器皿程序試驗原始結果記錄需要指導教師審查簽字。試驗后填寫儀器使用記錄。XX離開試驗課堂需要得到指導教師批準。試驗一質壁分別法測定細胞滲透勢一、原理：溶液中，經過一段時間以后，有的細胞吸取水分，細胞膨脹；有溶液的滲透勢，即為該組織細胞的滲透勢。二、材料與設備：植物材料：洋蔥鱗莖、大蔥、蠶豆葉片或其它植物葉片。設備：顯微鏡1XX、培育皿7套；滴管；載玻片、蓋玻片511試劑：1.00mol/L0.03%中性紅溶液.三、試驗步驟：以1.00mol/L蔗糖溶液為母液,依照公式C1V1=C2V2配制0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mol/L蔗糖溶液各10ml縮。用刀片在洋蔥鱗莖內表皮上劃出邊長為5mm的小方格，用鑷子剝取內表皮數塊浸入盛有0.03%中性紅溶液的小培育皿3min，取出后放入盛有自來水的小培育皿內，沖洗中上的多余水分。在盛有不同濃度蔗糖溶液的培育皿內分別放入染過色并漂洗后的內表皮數塊。20min后，按從高濃度到低濃度蔗糖溶狀況，求出組織細胞的等滲溶液濃度。四、結果計算：算植物細胞的滲透勢。Ψs=-iCRT〔MP〕ΨSMPi：為溶液的等滲系數〔蔗糖溶液的1。C：等滲溶液的濃度〔mol/L。T：為確定溫度，T=〔273+t℃〕K，t為試驗時的室溫。R：為氣體常數，R=0.008314〔L·MP/mol·k〕試驗二小液流法測定植物組織水勢一、原理水勢打算。物組織的水勢與溶液的滲透勢相等，則二者水分保持動態(tài)平衡，取浸過植物組織的溶液一小滴〔為了便于觀看可先染色的滲透勢等于組織的水勢。二、材料與設備：植物材料：胡蘿卜肉質根或其它作物的葉片。設備：XX〔12×10mm〕6〔均具塞；大試管〔5×0mm〕6支〔具塞；10ml2；1ml261111三、試驗步驟：11.00mol/LC1V1=C2V2配制一系列不同濃度的蔗糖溶液〔0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，按編號挨次在試管架上排成一列，作為比照組。26XX1ml3、取胡蘿卜肉質根〔或剪下具有代表性的穎葉片〕馬上XX8〔1mm〕左右，葉片材料放入20片左右。搖動小瓶，使植物材料浸入到20min。在此期間搖動小瓶2-3換。420min使溶液為藍色。按濃度依次分別用毛細吸管吸取少量藍色溶液，色溶液一小滴，漸漸取出毛細管〔留意幸免攪混溶液。觀看并記錄液滴的升降狀況：液滲透勢的平均值。四、結果計算記錄液滴靜止不動的試管中蔗糖溶液的濃度。水勢。Ψ=-iCRT〔MP〕WΨWMPi：為溶液的等滲系數〔蔗糖溶液的1。C：〔mol/L。T：為確定溫度：T=〔273+t℃〕K，t為試驗時的室溫。R：為氣體常數：R=0.008314〔L·MP/mol·k〕試驗三、葉綠體色素的提取、理化性質及定量測定葉綠體色素的提取、理化性質一、原理：葉綠體中含有綠色素〔葉綠素和b〕和黃色素〔胡蘿卜素和葉黃素。這兩類色素能溶于有機溶劑，且各種色素的脂溶性不同。依據它們在有機溶劑〔如乙醇、甲醇、丙酮等〕中的溶解特性，可將它們從葉子中提取出來。ZY熒光。二、材料與設備：植物材料：穎植物葉片?！?0ml〕1支；20ml刻度試管5支；5ml刻度試管2支；25ml刻度吸管2XX50%醋酸；KOH-甲醇溶液〔20克KOH溶于100ml甲醇中〕三、試驗步驟：色素的提取取洗凈穎的植物葉子510ml，研磨至丙酮染成深綠色，將丙酮提取液濾入小燒杯內，再用10ml丙酮重復研磨，過濾，濾液待用。1〕熒光現象色為暗紅色，這是葉綠素輻射熒光的現象；在透射光下為綠色，是由于葉綠素分子不吸取綠色光的緣由。皂化作用1.5ml20KOH5ml上搖勻。沿試管璧參加蒸餾水1ml，輕輕轉動試管，靜置于試b。取代作用[H+和Cu2+對葉綠素分子中Mg2+的取代]用移液管吸取葉綠素提取液5ml，放入試管中，參加50%醋酸數滴〔或濃L2滴，搖勻，可觀看到溶液由綠色變Mg2+被HH+被Cu2+取代，為銅代葉綠素。將兩試管中的溶液進展比較。葉綠素的吸取光譜與定量測定一、原理含量及吸取光譜的測定方法。b645nm663nmb的80%丙酮溶液的比吸取系數為82.04和9.72，在波長645nm下分別為16.7545.60。其關系式：D663=82.04C+9.72Cb(1)D645=16.75C+45.6Cb(2)35m和的光密度。C、Cb：分別為葉綠素、bmg/L解方程(1(2)得：C=12.7D663－2.59D645(3)Cb=22.9D645－4.67D663(4)CCb相加，既得葉綠素總量CTCT=C+Cb=20.3D645+8.03D663(5)b在m〔5，CD652×1000CT〔mg/L〕=————————(6)34.5二.材料和設備：試驗材料：菠菜葉片設備：756紫外分光光度計，電子天平，研缽一套，漏斗一個，25ml試劑：80%丙酮，CCO3粉末三.試驗步驟：葉綠素提取液的置備：稱取穎干凈的葉片〔去主脈〕0.1克，剪碎，放入研缽中，參加少量CCO3粉末和石英砂，參加80%丙酮，認真研磨成勻漿，再參加適量丙酮，連續(xù)研磨至組織殘渣變?yōu)榘咨?，靜止片刻，將提取液過濾至25ml容量瓶中，再用80%丙酮沖洗研缽和濾紙，將色素沖洗干凈，最終用80%25ml，搖勻、待用。光密度測定與吸取光譜掃描：以80%丙酮做比照，按以下步驟輸入程序：開機：依次翻開外部電源(如穩(wěn)壓器)、主機電源。儀器自檢：當翻開儀器電源時，儀器便進入自檢程序，自檢各項都“OK”后，進入選擇工作方式界面；預熱半小時后進展以下操作。光度測量未知葉綠素、b總濃度的測定：進入光度測量(652nm,)：按1s2鍵進入測3.3溶液。3.4測量：將取出的參比溶液倒掉，換上樣品溶液，放入第bs光譜測量測量。參數設置：按F1進入參數設置：〔1〕測量波長范圍〔2〕記錄范圍〔樣間隔m〔〕〔5〕掃描速度〔一般為中速。參數設置完后按鍵退出參數設置?；€校正：在第一樣品池中放入參比溶液，按比溶液。掃描：將取出的參比溶液倒掉，換上樣品溶液，放入第一樣品池中，按儀器自動進展掃描。四、葉綠素含量的計算：按公式3〔〕b濃度，也可按公式〔6〕直接算出葉綠素總濃度。然后按公式〔7〕或〔8〕算出葉綠素總含量：CT(mg/L)×提取液總體積(L)×稀釋倍數葉綠素含量〔鮮重%〕=—————————————————×100%(7)樣品鮮重〔mg〕CT(mg/L)×提取液總體積(L)×稀釋倍數———————(8)樣品鮮重〔g〕試驗四、植物根系活力的測定〔TTC法〕一、原理TTC法測定根系活力就是依據根系脫氫酶系氧化復原力量強弱而設計的。氯化三苯基四氮唑〔TTC〕是標準氧化復原電位為－80mvTTC植物根所引起的TTC復原，可因參加琥珀酸、延胡素酸、TTC復原量能表示脫氫酶活性，并作為根系活力的指標。二、材料與設備植物材料：水培或砂培植物幼苗的根，或認真洗凈泥土的植物幼苗的根。玉米根系興旺，是較好的試驗材料。設備：7211套；鑷子1把；漏斗1個；刻度吸管2ml1支、10ml2支、0.5ml1支；容量瓶10ml1個、刻度試管20ml6500ml1個；石英砂適量。試劑、乙酸乙酯〔分析純〕500ml；、分析純連二亞硫酸鈉〔N2S204〕粉末少許；、1%TTC溶液，準確稱取TTC1.000g，溶于水中，定容至0mH應在5H可先加少量酒精，使其溶解后再加水。、0.4%TTC溶液，準確稱取TTC0.400g，溶于水中，定容100ml；、5mol/L磷酸緩沖液〔0，配制方法為：液：稱取分析純N2HP04·2H2011.876g溶于蒸餾水中成1000ml，B4g溶于蒸餾水中成0m。60ml、B40ml1mol/L1.8455ml，邊攪邊參加盛有500mldH2O1000ml。三、試驗步驟〔定量測定〕ml0.4TTC溶液10mlN2S204些，以使TTC充分復原]，搖勻后馬上產生紅色的三苯基甲腙。05，0.50，0.75，1.00ml置10ml刻度試管中，分別加乙酸乙酯0.025，0.05，0.075，0.10mg的標準比色系列，以乙酸乙酯做空白作參比，在485nm波長下測定光密度。以TTC復原量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。剪取植物根尖1cm局部為試驗材料，稱取0.1g，放0.4%TTC10ml，把根充分浸在溶液內，在3740-60min，植物空白試驗為先加硫酸再參加根樣品，其它操作一樣。用鑷子將根夾出，沖洗后擦干外表水分，參加少許乙把紅色浸提液濾入試管，并用乙酸乙酯洗滌研缽中的殘渣2—3次，至到殘渣為白色。然后用乙酸乙酯將浸提液定容至5ml。〔先加硫酸到再參加根樣品操作得到的溶液〕作參比，讀出光密度，查標準曲線，求出TTC四、結果計算：TTC〔mg〕TTC復原強度=——————————————————〔mg·g-1·min-1〕根重〔g〕×酶促反響時間〔min〕試驗五、過氧化氫酶〔CT〕活性的測定一、原理：過氧化氫酶〔CT〕在植物體內普遍存在，它能把過氧化氫分表示。讓酶與定量的底物〔過氧化氫〕進展定時的反響，反響結束后，再用碘量法測定剩余的過氧化氫量。以鉬酸銨作催化劑，過酸鈉滴定碘，其反響為：I2+2N2S2O3→2NI+N2S4O6依據空白〔不加酶液〕和測定〔加酶液〕二者滴定值之差，即可求出酶分解的過氧化氫量。酶活性單位為：分解H2O2mg/g·min二、材料與設備植物材料：小麥或其它植物葉片100ml三角瓶4個；100ml250ml1支；恒溫水浴；漏斗110ml15ml21ml1試劑：碳酸鈣粉末。1.8mol/L1000ml燒杯1500mldH2O，邊攪拌邊參加100ml1000ml。10%鉬酸銨溶液。11g20ml調勻，漸漸傾入約80ml沸水中，在攪拌下加熱至重沸騰，冷卻后貯于滴瓶中。mol/LN2S2O3·5H2O25g溶1L。保存于棕色中，放置暗處，一天后進展標定。K2Cr2O70.15g500ml30mldH2O2gKI5ml6mol/L酸，在暗處放置5min，然后用水稀釋至200ml，用0.1mol/L1ml淀粉溶液，連續(xù)滴至溶液由蘭色變成亮綠色〔Cr+++離子的顏色〕N2S2O30.02mol/L硫代硫酸鈉：吸取20ml標定過的0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液，參加到100ml容量瓶中，加dH2O定容到刻度。留意現用現配。0.06mol/L1ml30dH2O150ml。三、試驗步驟：1、酶液提?。悍Q取剪碎混勻的穎小麥葉片1g置于研缽中，加0.2g碳酸鈣和dH2O2ml，認真研磨成勻漿。過濾至100mldH2O10mldH2O2100ml45ml，馬上向3、4號瓶中參加1.8mol/L硫酸3ml，終止酶的活性，作20℃水浴中保溫，10min3ml0.06mol/L讓酶作用n12號瓶各參加lL硫酸。41ml20%碘化鉀、3d5d0.02mol/L四、過氧化氫酶活性的計算：可求出此期間過氧化氫酶所分解的過氧化氫量。[空白滴定值〔ml〕－樣品滴定值〔ml〕]=—————————————————×硫代硫酸鈉〔mol/L〕×342注：34H2O2H2O2〔mg〕———————————×酶液總體積〔ml〕測定時用酶液〔ml〕CT活性〔H2O2mg/g·min〕=—————————————————樣品重〔g〕×時間〔min〕試驗六、植物硝酸復原酶(NR)活性的測定一、原理：硝酸復原酶〔NR〕是植物氮素同化的關鍵酶，它催化植物體內的硝酸鹽復原為亞硝酸鹽。其反響式為：NO3-+NDH+H+—→NO2NDH2O。硝酸復原酶活性凹凸以生成生成的亞硝態(tài)氮含量表示，即以NO2-ug/g.h為單位。NO2-含量的測定可用磺胺比色法，該方法能測定的NNO2濃度為0.5ug/ml?！不驅?氨基苯磺酰胺及α-萘胺〔或萘基乙烯胺〕在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。540nm光度計測定。簡潔，硝酸復原酶不用從植物組織中提取出來，其作用產物NO2NO2-含量的增加，即能說明酶活性的大小。硝酸復原酶是一種誘導酶，當向培育介質中參加硝酸鹽時，植物體內很快就會消滅硝酸復原酶。二、材料設備：植物材料：小麥、玉米或其它植物材料的葉片。設備：分光光度計；真空抽氣裝置；溫箱；打孔器；電5ml22ml4試劑：0.2mol/L10.11g硝酸鉀于dH2O中，500ml。、0.1mol/LPH=7.52L4,O溶解，1000ml液：0.2mol/LN2HPO4，取N2HPO471.7g，dH2O1000ml16ml、B84ml，混合，用dH2O200ml。1g磺胺〔或對氨基苯磺酸加25ml濃鹽酸，dH2O100ml。、α-萘胺試劑：0.2gα-萘胺溶于含1mldH2O100mlα-萘胺溶于25mldH2O100ml。RNNO20.1000gdH2O溶解、定溶至100ml5ml，再用dH2O稀釋至1000ml，NO25ug/ml三、試驗步驟1、將穎的葉片用水洗凈，吸水紙吸干外表水分，然后用1cm2〔0.2—g，用O洗滌—3次，吸干水分，分別置于含有以下溶液的2個l三角瓶中〔1L磷酸緩沖液5ml+dH2O5ml,(2)0.1mol/L磷酸緩沖液(PH7.5)5ml+mol/LKNO35ml瓶置于真空枯燥器中，接上真空泵抽氣7-10min，放氣后，園片即沉于溶液中。將三角瓶置于30℃溫箱中，不見光，保溫30min。合物，假設組織中的碳水化合物含量低，會使酶的活性降低。2、NO2-含量測定：保溫30min完畢后，分別取出1ml反響液于試管中，參加30℃30min，用NO2NO2-ug/g.h。試劑，每參加一種試劑后留意搖勻。待試劑加完后，將各試管置30℃溫箱中保溫30min，馬上于520nm波長下進展比色，讀出光密度，以光密度為縱坐標，NO2-濃度為橫坐標繪制標準曲線?！袅粢猓簻y定NO2-的磺胺比色法很靈敏，可以檢出低于1ug/ml的NNO2含量，由于顯色反響的速度與重氮化作用及則顯色速度相等，彼此可以比較。四、結果計算:g·g1·h-1〕試驗七、植物細胞膜透性的測定一、原理：植物組織受不良環(huán)境條件〔如干旱、低溫、高溫、鹽漬和大氣污染〕危害時，細胞膜的構造和功能首先解質的含量增加。組織受損害越嚴峻，電解質含量增加得越高。弱。二、材料與設備：植物材料：選取小麥或其它作物肯定葉位和葉齡的功能葉片。三角瓶112試劑：ddH2O或去離子水。三、試驗步驟：1、清洗用具：電導法對水和容器的干凈度要求嚴格，器皿的盤中。2、取樣及處理：分別在正常生長和逆境脅迫的植株上取同2中一份低溫處理：放在-20℃左右的溫度下冷凍20min〔或高溫處理：置0℃左右的恒溫箱中處理n；另一份裹入潮次，用干凈的濾紙吸干，然后用打孔器〔1cm2〕1220ml的無離子水，浸沒葉片，然后放入真空抽氣裝置中抽氣約10min，以抽出細胞間隙空氣，緩緩放氣，水即滲入細胞間隙，30min，間或搖動幾次。3、測定：將電導儀的電極插入三角瓶中，測定外滲液的電導值，記錄其初始電導值〔15min，以殺死組織。待冷至室溫后，再次測定外滲液的電導值〔2。四、結果計算：按下式計算相對電導度：相對電導度的大小表示細胞受損害程度。由于比照〔在室溫下也有少量電解質外滲，故可按下面公式計算由于高溫或低溫脅迫而產生的外滲，稱為損害度。損害度〔%〕=〔Lt–Lck〕/〔1-Lck〕×100%式中：Lt——處理葉片的相對電導度；Lck——比照葉片的相對電導度。試驗八、植物光合速率的測定一、原理：CO2H2O〔進入葉室氣體中的CO2和H2O濃度和流出葉室氣體中的CO2和H2O濃度〔分析氣〕的濃度差值來實現的。CO2對紅外線的最大吸取波長是4.26μm.。TPS利用這一CO2的。儀器測定參數：光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、葉片溫度、細胞間隙CO2濃度、大氣濕度、大氣溫度、大氣CO2濃度、光合有效輻射、光—光合響應曲線、CO2—光合響應曲RuBPCO2CO2RuBP最大再生速率以及光合作用氣孔限制值等一些格外有用的生理生態(tài)參數。二、材料與設備：材料：綠色植物葉片設備：英國PP公司TPS-1便攜式光合作用測定系統(tǒng)。TPS-1由主機和葉室兩局部組成。三、操作步驟：TPS假設TPS與葉室連用，在翻開電源之前要確定葉室與TPS-1系統(tǒng)是否正確連接，假設正確連接，開機后TPS-1系統(tǒng)會自動檢測。檢查吸取管中的化學試劑，必要時應更換〔參考吸取管和化學試劑的環(huán)境條件局部?！粽介_機操作：第一步：翻開TPS-1系統(tǒng)電源：大約7秒鐘后顯示主菜單〔CHECKSUMERROR或：為參比CO2+/-nnn：為分析氣與參比氣CO2濃度ppm為單位；Q：為光量子通量密度，以μ mol·m-2·s-1為單位〔0；H：為參