蛋白質(zhì)定量分析

蛋白質(zhì)定量分析第1頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四定性分析定量分析有沒(méi)有是不是有多少第2頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)定量分析的方法操作注意事項(xiàng)思考討論第3頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

2.掌握分光光度計(jì)的使用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握BCA法測(cè)定血清蛋白質(zhì)濃度的原理。第4頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四BCA分子式BCA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸）第5頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)原理紫藍(lán)色562nm第6頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)步驟（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、器材721型分光光度計(jì)、恒溫水浴箱、移液管、試管

2、試劑（1）試劑A:含1%BCA二鈉鹽、2%無(wú)水碳酸鈉、0.16%酒石酸鈉、0.4%氫氧化鈉、0.95%碳酸氫鈉，將上述液體混合后調(diào)pH至11.25。（2）試劑B：4%硫酸銅。（3）BCA工作液：試劑A100mL+試劑B2mL，混合。（4）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取150mg牛血清白蛋白，溶于

100mL蒸餾水中，即為1.5mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。（5）待測(cè)樣品。第7頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

表1BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

管號(hào)試劑（mL）

空白管

1

2

3

4

5

測(cè)定管

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（0.3mg/ml）

—

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

—

蒸餾水

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

—

—

待測(cè)樣品

—

—

—

—

—

—

0.5

BCA工作液

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

蛋白質(zhì)含量g

30

60

90

120

150

數(shù)據(jù)有改動(dòng)ug第8頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1、將上述各管混勻后于37°C保溫30分鐘，用562nm波長(zhǎng)比色測(cè)定吸光度值。2、以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、用測(cè)定管光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量M，再計(jì)算出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度（g/L)。 （二）實(shí)驗(yàn)操作C=MV——×250第9頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)定量分析的方法紫外線吸收法改良微量凱式定氮法雙縮脲法

Folin-酚試劑法考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法

BCA法280nm16%第10頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四方法靈敏度時(shí)間原理干擾物紫外線吸收法較低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收核苷酸改良凱氏定氮低費(fèi)時(shí)將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮雙縮脲法低中速肽鍵和堿性Cu2＋形成紫色絡(luò)合物硫酸銨；Tris緩沖液某些氨基酸Lowry法高費(fèi)時(shí)雙縮脲反應(yīng)；酚試劑被還原甘氨酸硫醇考馬斯亮藍(lán)法高快速G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合物在595nm的光吸值強(qiáng)堿性緩沖液TritonX-100;SDSBCA法最高較快肽鍵和堿性Cu2＋形成紫色絡(luò)合物不受去污劑、尿素等的影響第11頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

BCA法的特點(diǎn)

1、操作簡(jiǎn)便，快速2、準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好

3、抗試劑干擾能力較強(qiáng)4、經(jīng)濟(jì)實(shí)用第12頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)分組2、準(zhǔn)確量取試劑，吸管殘余液體要吹出。3、平行加樣，物歸原位。4、正確使用分光光度計(jì)，比色杯不潤(rùn)洗。5、正確繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)注名稱、姓名、儀器型號(hào)、作圖時(shí)間。6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果書寫規(guī)范，三線表。第13頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四可見光分光光度計(jì)的操作步驟：1）預(yù)熱儀器。2）選定波長(zhǎng)。3）固定靈敏度檔。一般固定在“1”檔。4）調(diào)節(jié)“0”點(diǎn)。5）調(diào)節(jié)T=100％。6）測(cè)定。7）關(guān)機(jī)。（重復(fù)2-3次）第14頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四表1BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量管號(hào)空白管12345測(cè)定管M（ug）306090120150？吸光值儀器型號(hào)：721/722型波長(zhǎng)=562nm第15頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四思考討論1、蛋白質(zhì)定量分析的多種方法中，哪種方法更適合測(cè)定血清蛋白的濃度，說(shuō)出你的理由？2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，有沒(méi)有可改進(jìn)的方法，如果有請(qǐng)說(shuō)出你的想法？第16頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

下次實(shí)驗(yàn)：血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

預(yù)習(xí)要點(diǎn)：1、復(fù)習(xí)蛋白質(zhì)兩性解離。2、預(yù)習(xí)電泳的基本原理。3、請(qǐng)簡(jiǎn)要寫出操作流程圖。4、請(qǐng)寫出計(jì)算公式。第17頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第18頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

一、蛋白質(zhì)的相關(guān)理論知識(shí)16%蛋白質(zhì)的平均含氮量樣品中蛋白質(zhì)的含量=樣品中氮含量÷16%（或×6.25）凱氏定氮法1、元素組成第19頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

2、蛋白質(zhì)的紫外吸收280nm蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰紫外線吸收法共軛雙鍵第20頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，