第三章凝膠分離技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)：1、凝膠為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子發(fā)生任何作用，因此分離條件溫和，產(chǎn)物收率高，重現(xiàn)性好；2、應(yīng)用范圍廣，所分離物質(zhì)分子量覆蓋面大，可分離從幾百到數(shù)百萬分子量的物質(zhì)；3、設(shè)備簡單，操作方便，周期短，可反復(fù)使用。凝膠分離已成為一種通用的分離方法，在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、酶、核酸、激素、多糖等）的制備與生產(chǎn)技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。目前一頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)第一節(jié)凝膠分離原理一、凝膠分離原理當(dāng)被分離物質(zhì)的分子大小不同時，能夠進(jìn)入到凝膠內(nèi)部的能力也不同。凝膠中的孔隙大小與分子大小有相仿的數(shù)量級。當(dāng)混合物通過凝膠時，比孔隙小的分子可以自由進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而比孔隙大的分子就不能進(jìn)入，因此在移動速度方面就出現(xiàn)差異，從而使不同相對分子質(zhì)量的各組分得到分離。目前二頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)目前三頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)目前四頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)分離原理可用下式表示：VR=V0+kVi式中：VR：保留體積（洗脫體積）V0：柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相體積——外水體積Vi：凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積——內(nèi)水體積k：分配系數(shù)目前五頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)被分離物質(zhì)分子很大，被完全排阻于凝膠顆粒之外：k=0，VR=V0；被分離物質(zhì)分子很小，能完全自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部：k=1，VR=V0+Vi；中等大小的分子，只能達(dá)到部分凝膠顆粒內(nèi)部：0＜k＜1，V0＜VR＜V0+Vi。目前六頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)Vo、Vi的測定①Vo的測定

選用分子量約200萬的藍(lán)色葡聚糖-2000（或一種不被凝膠滯留的有顏色的大分子物質(zhì)，便于觀察)，測定它的洗脫曲線，洗脫峰峰頂洗出的體積就是該柱的Vo值。②Vi的測定選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測出其洗脫體積，減去Vo就是該柱的Vi。常用鉻酸鉀(黃色)或有UV吸收的物質(zhì)如N-乙酰酪氨酸乙酯來測定。目前七頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)分配系數(shù)k的計(jì)算：k=（VR-V0）/Vi目前八頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)分子量與洗脫體積的關(guān)系：lgMr=-k`VR+Vo（成立？）Mr很大時，達(dá)到上限？Mr很小時，達(dá)到下限？目前九頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)二、常用凝膠葡聚糖凝膠(dextrangel，Sephadex)聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel，Bio-GelP)瓊脂糖凝膠(agarosegel，Sepharose)瓊脂糖及葡聚糖組成的復(fù)合凝膠(Superdex)此外還有葡聚糖醚、聚甲基丙烯酸醋、聚苯乙烯等制成的凝膠目前十頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)1、葡聚糖凝膠

葡聚糖凝膠在水、醇、乙二醇、甲酸胺、二甲基甲酸胺、二甲亞楓等溶劑中都可吸液膨脹,但吸收溶劑的量與膨脹后的體積視溶劑而異。凝膠充分膨脹的時間隨交聯(lián)度而不同,交聯(lián)度越小所需時間越長,加熱可以縮短吸水膨脹時間。目前十一頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)葡聚糖和3-氯-1，2環(huán)氧丙烷以醚鍵相互交聯(lián)形成。按交聯(lián)度大小分8種型號，G值代表不同交聯(lián)度。SephadexG-10，15，25，50，75，100，150，200數(shù)字表示每克干膠膨脹時吸水量的10倍。SephadexG-25代表每克干膠膨脹時可以吸水2.5克。目前十二頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)葡聚糖凝膠目前十三頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)目前十四頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)葡聚糖凝膠只能應(yīng)用于水溶性物質(zhì)與水溶液或類水溶液,但如在葡聚糖分子上引入有機(jī)基團(tuán)則可以增大其有機(jī)性質(zhì)而使之呈親脂性。如LH-20型葡聚糖凝膠即為在G-25型凝膠上引入羥丙基基團(tuán),使糖分子與醚鏈相連。這種凝膠既有親水性,又有親脂性,可以在多種有機(jī)溶劑中膨脹后應(yīng)用,如氯仿、丁醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)等,但在苯、乙酸乙酯等溶劑中膨脹不多,較少應(yīng)用。用氯仿時,因凝膠比重較小,所以要采取措施,使凝膠不能浮起,也可改用上行法。目前十五頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)2、聚丙烯酰胺凝膠目前十六頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)目前十七頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)3、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠與前二種不同,它不是以化學(xué)鍵共價(jià)鍵交聯(lián)的,而是以氫鍵交聯(lián),不同的孔隙程度是由改變瓊脂糖的濃度而達(dá)到的,因此穩(wěn)定性有一定限制。沒有干的凝膠,必須在膨脹狀態(tài)保存,遇脫水劑、冷凍和有機(jī)溶劑即破壞。pH在4-9之間、溫度在0-40℃之間穩(wěn)定,超出此范圍即破壞。目前十八頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)目前十九頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)三、凝膠特性參數(shù)1、排阻極限：指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量，即相對分子質(zhì)量大于該數(shù)值的分子不能進(jìn)入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中，其洗脫體積為Vo。如SephadexG50的排阻極限為30000。2、分級范圍：即能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量范圍。如SephadexG50的分級范圍為1500-30000。目前二十頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)3、凝膠粒徑：凝膠一般為球形，其粒徑越小，HETP（理論板當(dāng)量高度）越小，分辨率越高。凝膠粒徑多用篩目或微米表示。如軟粒凝膠一般為50-150微米（100-300目），硬粒凝膠一般為5-50微米。4、空隙體積：指柱中凝膠之間空隙的體積，即Vo?？障扼w積可用相對分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測定，如相對分子質(zhì)量為200萬的水溶性藍(lán)色葡聚糖。目前二十一頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)5、溶脹率：溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分?jǐn)?shù)稱為溶脹率，即溶脹率=×100%如SephadexG50的溶脹率為500%±30%。6、床體積：指1克干膠充分溶脹后所占有的體積。如SephadexG50的床體積為9-11mL/g干膠。凝膠的床體積可用于估算裝滿一定體積的凝膠柱所需的凝膠干粉量。

目前二十二頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)第二節(jié)凝膠分離應(yīng)用凝膠分離特點(diǎn)(1)溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生相互作用，操作條件溫和，回收率可接近100%；(2)批次之間不需要進(jìn)行苛刻的介質(zhì)清洗或再生，容易實(shí)現(xiàn)循環(huán)操作；(3)分離機(jī)理簡單、操作參數(shù)少、容易規(guī)模放大；(4)僅根據(jù)分子量進(jìn)行分離，選擇性較低，處理量小。目前二十三頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)一、凝膠的選擇與處理1、排阻范圍的選擇目前二十四頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)2、粒度的選擇目前二十五頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)3、凝膠用量的選擇

干凝膠用量（g）：πr2h/床體積理論用量×（1+10%）=凝膠處理量目前二十六頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)4、凝膠的處理（1）除去影響流速的過細(xì)顆粒

“水力浮洗法”：將顆粒粗細(xì)不均的凝膠懸浮在大體積的水中，讓它自然沉降，過細(xì)的顆粒浮在上面，倒去即可。反復(fù)幾次。（2）溶脹使用前需直接在欲使用的洗脫液中浸泡溶脹。通常使用“熱法”溶脹，即在沸水浴中，將懸浮于洗脫液中的凝膠漿逐漸升溫到近沸，1~2小時即可。

沸水溶脹不但節(jié)省時間，還可以殺滅凝膠中污染的細(xì)菌并排除氣體。目前二十七頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)（3）為了保證流速穩(wěn)定，獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用前用傾瀉法傾去不易沉下的較細(xì)顆粒，使凝膠顆粒大小一致。目前二十八頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)5、柱結(jié)構(gòu)（φ、h）的選擇目前二十九頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)柱太短，影響分離效果；柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)：內(nèi)徑過細(xì)（小于1cm），會發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果；過大（大于5cm）則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例：對于除鹽來說應(yīng)為1︰5～1︰25；對于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1︰20～1︰100。目前三十頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)二、凝膠分離操作技術(shù)1、凝膠裝柱①將層析柱垂直裝載支架上，將下端輸液管夾緊；②向柱中加入約1/3體積的0.9％NaCl溶液（或洗脫液）；③將一細(xì)玻棒伸入柱內(nèi)，靠近管內(nèi)壁，順著玻棒緩慢的向管內(nèi)加入混勻的凝膠溶液；2·min。⑤連續(xù)而緩慢的加凝膠直到穩(wěn)定在離管口約5cm處。注意：防止空氣進(jìn)入凝膠床目前三十一頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)裝柱操作注意事項(xiàng)：灌注凝膠時要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時斷時續(xù)，否則將出現(xiàn)分層或“紋路”等毛病。若出現(xiàn)這些現(xiàn)象，可以用玻璃棒將已經(jīng)形成的柱床逐步攪起，直至出毛病的地方，再繼續(xù)加入攪勻的凝膠懸液。若在灌好凝膠后才發(fā)現(xiàn)“紋路”、分層等現(xiàn)象時，要重新裝柱，以免影響層析效果。在做大型的凝膠柱時，灌注的凝膠是否均勻往往從表面上看不出來，所以使用前應(yīng)用一些帶色的大分子物質(zhì)如細(xì)胞色素C、血紅蛋白或?qū)Ｓ玫乃{(lán)色葡聚糖—2000（Bluedextran-2000）通過凝膠柱，以檢查形成的帶色斑帶是否整齊，若斑帶歪斜，應(yīng)該重新裝柱，直至達(dá)到要求。目前三十二頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)注1：剛從冰箱中取出的凝膠液，不能馬上用來灌柱，應(yīng)平衡至室溫后再用，不然裝好的凝膠柱會產(chǎn)生大量的氣泡影響層析。注2：在整個灌注凝膠的過程及使用中，凝膠柱面上一定要覆蓋著一層溶液，以免進(jìn)入空氣。若進(jìn)空氣，在加入溶液時，凝膠柱中易形成氣泡。注3：裝好的凝膠柱，使用時應(yīng)該用相當(dāng)于柱體積兩倍或更多的洗脫液流過洗脫柱，以壓實(shí)凝膠。目前三十三頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)2、樣品的上柱及洗脫①加樣量的控制分析：1-2ml/100ml床體積，制備：10-30ml/100ml床體積②洗脫液的選擇：首先洗脫液最好與浸泡凝膠時所用的溶液一致，否則由于更換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化而影響分離效果；水溶性物質(zhì)的洗脫用水或具有不同離子強(qiáng)度和pH的緩沖液，非水溶性物質(zhì)的洗脫用有機(jī)溶劑（苯、丙酮等）。目前三十四頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)葡聚糖基本上不帶電荷、呈惰性，不與被分離的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以分離的效果較好。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羥基，能吸附少量蛋白質(zhì)等被分離的物質(zhì)。為了克服這個缺點(diǎn)，一般使用含有離子強(qiáng)度達(dá)0.08的NaCl等中性鹽作洗脫液。目前三十五頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)凝膠層析加樣操作示意圖目前三十六頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)圖注：1、平衡好的層析柱。2、沿管壁將樣品溶液小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將床面凝膠沖起。3-4、打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時收集流出液，5-7、當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1mL洗脫液沖洗管壁2次。8-9、最后加入3—4mL洗脫液于凝膠上。10、連接柱層析系統(tǒng)，自動收集記錄。目前三十七頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)凝膠分離洗脫與自動收集系統(tǒng)目前三十八頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)實(shí)物圖目前三十九頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)凝膠層析中的分離行為

藍(lán)葡聚糖（蘭色）、血紅蛋白（紅色）、鉻酸鉀(黃色)目前四十頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)3、凝膠的回收與保存凝膠一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02％的疊氮化鈉，在下次層析前將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。目前四十一頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)三、影響凝膠分離的因素1、流速對蛋白質(zhì)分辨率的影響目前四十二頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)2、黏度對分辨率的影響目前四十三頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)3、凝膠柱層析操作壓操作壓的增加會影響流速（變快？變慢？），此外還可以導(dǎo)致凝膠膠面下降，柱床容積的改變，相應(yīng)測出的Vt，Vo，Ve等也改變，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。目前四十四頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)操作壓與流速的關(guān)系目前四十五頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)4、加樣量對分辨率的影響

I.加樣量少時，A、B二種物質(zhì)完全分開。

II.加樣量適當(dāng)時，A、B二種物質(zhì)剛剛分開。III.加樣量太大時，A、B二種物質(zhì)只能部分分開。目前四十六頁\總數(shù)五十頁\編于六點(diǎn)（1）分析工作時，樣品體積為柱床體積的1~4%；