DB12T 1190-2023牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.30CCSB4512CodeofpracticeforidentificationofA2typeofβ-casein(A2milk)incow'smilkIDB12/T1190—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：馬毅、譚冬飛、陳麗麗、趙康、張漫、蘆娜、王麗學(xué)。1DB12/T1190—2023牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鑒別技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了的牛奶中A2型β-酪蛋白（A2奶）的檢測(cè)原理、主要試劑配制、主要儀器設(shè)備、質(zhì)譜檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理參數(shù)、檢測(cè)方法、結(jié)果判定、廢棄物的處理和檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施。本文件適用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2β-酪蛋白由209個(gè)氨基酸組成，其一級(jí)序列中的第67位氨基酸的種類為脯氨酸（Proline,P）時(shí)，稱為A2型β-酪蛋白。3.2A2奶A2milk所含β-酪蛋白為A2型的牛奶。3.3質(zhì)荷比mass-to-chargeratio離子的質(zhì)量m與其所帶的電荷數(shù)z之比，以m/z表示。4檢測(cè)原理β-酪蛋白變體型對(duì)應(yīng)的氨基酸突變位點(diǎn)為第67位組氨酸（Histidine,H）突變?yōu)楦彼幔≒roline,P），不同氨基酸之間存在分子量差異。利用質(zhì)譜分析技術(shù)，根據(jù)差異肽段的分子量及質(zhì)荷比差異將樣品蛋白質(zhì)中存在氨基酸突變的肽段鑒定出來(lái)，從而確定氨基酸突變位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同突變體型β-酪蛋白檢測(cè)的目的。5試劑配制實(shí)驗(yàn)所用水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水；高壓滅菌條件為121℃,1.034*105Pa壓力，蒸汽滅菌20min。試劑配制如下：2DB12/T1190—2023——樣品裂解液：將480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L；——10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：將10gSDS粉末溶于80mL蒸餾水中，加熱至68℃助溶，用HCl調(diào)pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的濾膜過(guò)濾，高壓滅菌；——30%丙烯酰胺：將29g丙烯酰胺和1gN,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60mL的蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL；——1.5mol/LTris-HCl（pH=8.8）：將181.65gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調(diào)pH至8.8，容至1000mL；——1mol/LTris-HCl（pH=6.8）：將121.1gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調(diào)pH至6.8，容至1000mL；——10%過(guò)硫酸銨：將10g過(guò)硫酸銨粉末溶于80mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL；——考馬斯亮藍(lán)染色液：量取甲醇45mL，蒸餾水45mL，冰乙酸10mL，加入0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250；——考染脫色液：50mL碳酸氫銨/乙腈=1：1；——1μg/μL胰蛋白酶：將100μg胰蛋白酶溶解到100μL50mmol/L乙酸中，-70℃儲(chǔ)存；——25mmol/L碳酸氫銨：將2.0碳酸氫銨溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L。6儀器設(shè)備6.1單道可調(diào)移液器0.25～2.5μl、1～10μl、2～20μl、5～50μl、10～100μl、20～200μl、100～1000μl。6.210K超濾管超濾管截留蛋白分子量：30～90KDa。6.3離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速12000r/min，最大容量24×1.5mL。6.4電子天平萬(wàn)分之一精度。6.5凝膠成像分析系統(tǒng)有膠像素1280×1024，檢測(cè)靈敏度DNA≥0.05ng。6.6穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀輸出電壓0～600V，輸出電流0～100mA。6.7垂直電泳槽外形尺寸15cm×12cm×13cm，凝膠板面積10cm×10cm。6.8高壓滅菌鍋使用溫度范圍45～135℃,最高使用壓力0.255Mpa。6.9自動(dòng)雙重純水蒸餾器3DB12/T1190—2023功率3000W，出水量2500mL/h。6.10微波爐功率700W，容積20L。6.11冰箱6.12電熱恒溫水浴鍋RT+5～70℃7質(zhì)譜檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理參數(shù)應(yīng)按照附錄A執(zhí)行。8檢測(cè)方法8.1樣本采集每頭奶牛采集新鮮牛奶（排除頭奶和末乳）50mL，充分混勻后，-80℃保存。8.2蛋白提取8.2.1從-80℃取出牛奶樣本，常溫解凍后充分混勻，取樣50μL。8.2.2向上述樣品中加入500μL裂解液[8mol/L尿素，30mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）]。冰上裂解10min。4℃,20000g，離心30min。取上清，避免吸到油脂。8.2.3加入二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度10mmol/L。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至終濃度55mmol/L，暗室靜置1h。8.2.4使用考馬斯藍(lán)染色法（Bradford法）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。8.2.5對(duì)定量后的蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分析（如附錄C.1）。8.3蛋白質(zhì)的消化8.3.1取8.2.5中蛋白20μg，加入到10K超濾管中，14000g，4℃,離心40min，棄廢液。8.3.2加入200μL的25mmol/L碳酸氫銨（NH4HCO3），14000g，4℃,離心40min，棄廢液。8.3.3重復(fù)8.3.2步驟兩遍。8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。離心收集消化后的肽段。8.3.5真空抽干消化后的肽段。8.3.60.1%甲酸（FA）復(fù)溶肽段。8.4質(zhì)譜鑒定8.4.1將8.3.5提取的酪蛋白肽段進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。使用高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)獲得的酪蛋白肽段進(jìn)行分離并檢測(cè)，液相及質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表1～表3。4DB12/T1190—2023表1液相色譜柱參數(shù)表2液相色譜流動(dòng)相洗脫梯度025表3質(zhì)譜檢測(cè)-離子源參數(shù)數(shù)據(jù)依賴型采集(Independentdataacqui8.4.2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、峰提取和篩選，確定特征性肽段。質(zhì)譜掃描完畢，得到質(zhì)譜原始文件，將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入后，進(jìn)行一級(jí)色譜峰的濾噪、峰提取、篩選出含有p.67位氨基酸的特征肽段，5DB12/T1190—2023篩選參數(shù)見表4。表4質(zhì)譜峰篩選參數(shù)38.4.3篩選后的差異性肽段用Proteinpilot軟件進(jìn)行差異肽段序列的比對(duì)和鑒定，檢索參數(shù)見表5。表5鑒定檢索參數(shù)1/_Bosta9結(jié)果判定9.1SDS鑒定將從樣品中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS分離鑒定，檢測(cè)蛋白條帶是否清晰無(wú)降解。條帶清晰，表示可用于后續(xù)檢測(cè)，否則重新取樣鑒定，檢測(cè)結(jié)果見圖1。6DB12/T1190—2023圖1SDS檢測(cè)結(jié)果（紅框內(nèi)條帶為β-酪蛋白）9.2A2型β-酪蛋白的判定根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，當(dāng)待測(cè)樣品的中p.67H氨基酸突變?yōu)閜.67P（如圖2檢測(cè)結(jié)果表述為“A2注：虛線框內(nèi)為不同變體型β-酪蛋白的突變位點(diǎn)。圖2A2型β-酪蛋白對(duì)應(yīng)的氨基酸序列10廢棄物處理應(yīng)按照GB/T19495.2的規(guī)定執(zhí)行。11交叉污染防止措施應(yīng)按照GB/T19495.2的規(guī)定執(zhí)行。7DB12/T1190—2023（規(guī)范性）特征肽段質(zhì)譜圖篩選并鑒定到的特征性肽段為L(zhǎng)VYPFPGPIPN(59位到68位)，肽段中N端碎片離子為b離子模式，C端碎片離子為y離子模式，b2代表肽段中N端前兩個(gè)氨基酸組成