DB5206T81-2018紅薯脫毒種薯檢驗規(guī)程

ICS65.020B30銅仁市DB5206地方標(biāo)準(zhǔn)DBT18代替DB522200/T62-2009銅仁市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB5206/T81－2018目次前言 IIDB5206/T81－2018前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。請注意：本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)代替DB522200/T62-2009《紅薯脫毒種薯檢驗規(guī)程》。主要變化是進行編輯性修本規(guī)程由銅仁市農(nóng)業(yè)委員會提出并歸口。本規(guī)程起草單位：銅仁市種子管理站。本規(guī)程參加單位：思南縣農(nóng)牧科局、松桃縣種子管理站、沿河縣種子管理站、石阡縣種子管理站、印江縣種子管理站、萬山區(qū)種子管理站、玉屏縣種子管理站、德江縣種子管理站江口縣種子管理站、本規(guī)程主要起草人：李朝霞、李永鳳、甘坤俊、羅會群、鄧婭、代洪江、冉小芳、安興智、張羽軍、王顯權(quán)、廖雪紅、石俊、陳正福、陳忠本標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：──DB522200/T62-2009。1DB5206/T81－2018紅薯脫毒種薯檢驗規(guī)程1適用范圍本規(guī)程規(guī)定了各級紅薯脫毒種薯(苗)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、檢驗方法、判定規(guī)則。本規(guī)程適用于紅薯脫毒種薯(苗)繁育、生產(chǎn)、銷售過程中的質(zhì)量鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。NY/T1200甘薯脫毒種薯3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本規(guī)程。3.1脫毒試管苗應(yīng)用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得，經(jīng)檢測確認(rèn)不帶紅薯羽毛狀斑駁病毒、紅薯潛隱病毒、紅薯褪綠斑病毒的試管苗。3.2脫毒種薯(苗)從育種家種子繁殖試管苗開始，經(jīng)逐代繁殖增加脫毒種薯(苗)數(shù)量的種薯生產(chǎn)體系生產(chǎn)出來的種薯(苗)。分為育種家種子、原原種、原種、生產(chǎn)用種四個級別。3.2.1育種家種子由育種家直接生產(chǎn)和掌握的原始種子，具有該品種的典型性和遺傳穩(wěn)定性，純度100%，不帶病毒和其它病蟲害，產(chǎn)量及其它主要性狀符合推廣時的原有水平。3.2.2原原種：用育種家種子或典型品種的脫毒試管苗在防蟲網(wǎng)室、溫室條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯苗。3.2.3原種：用原原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯(苗)。3.2.4生產(chǎn)用種：用原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯(苗)。3.3病蟲害允許率指脫毒種薯(苗)繁殖田中病害株比率和蟲害株比率。3.3.1病害株：主指脫毒種薯(苗)病毒病株、真菌病株、細(xì)菌病株的比率。2DB5206/T81－20183.3.2蟲害株：主指脫毒種薯(苗)蟲害株比率。3.4混雜株允許率主指脫毒種薯(苗)繁殖田中混雜其它紅薯品種植株比率。3.5薯塊整齊度單塊質(zhì)量在100g—500g的塊根質(zhì)量占塊根總質(zhì)量的比率。3.6有缺陷薯指機械損傷、蟲鼠傷、畸形塊根質(zhì)量占塊根總質(zhì)量的比率。3.7雜質(zhì)指浮土、塊根上所沾的泥土、無種用價值的塊根，以及其他有機、無機質(zhì)量。4控制和汰除的病害4.1控制的病害指通過控制病害的發(fā)生程度以達到脫毒種薯(苗)質(zhì)量要求的病害。主指紅薯的病毒病(即紅薯羽狀斑駁病毒、紅薯潛陷病毒、紅薯褪綠病毒)、黑斑病、瘡痂病、蔓割病、莖線蟲病。4.2汰除的病蟲害指不能在達到質(zhì)量要求的脫毒種薯(苗)上發(fā)生的病蟲害。包括：根結(jié)線蟲病、細(xì)菌性萎蔫病(紅薯瘟)、根腐病、紅薯蟻象。5質(zhì)量要求5.1各級別脫毒種薯(苗)繁殖田中帶病植株允許率應(yīng)符合附錄A表A.1要求。5.2各級別脫毒種薯塊根質(zhì)量指標(biāo)應(yīng)符合附錄A表A.2要求。6檢驗方法6.1脫毒苗的檢驗?zāi)骋黄贩N經(jīng)莖尖分生組織獲得一批組培再生苗后，要逐株鑒定帶病毒狀況，經(jīng)檢測確認(rèn)不帶紅薯羽毛狀斑駁病毒、紅薯潛隱病毒、紅薯褪綠斑病毒的組培苗才能確認(rèn)是脫毒苗。檢測方法：有目測法、指示植物確認(rèn)法、血清法(酶聯(lián)免疫檢測)。6.1.1目測法目測法是根據(jù)紅薯葉片和薯塊上出現(xiàn)的典型癥狀判斷紅薯是否感染病毒。紅薯病毒病的癥狀主要包括：(1)葉斑型：主要有紫色羽狀斑、紫斑、紫環(huán)斑、黃色斑或者枯斑。(2)花葉型：苗期感病后，初期葉脈呈網(wǎng)狀透明，然后沿葉脈出現(xiàn)不規(guī)則黃綠相間的花葉斑紋。3DB5206/T81－2018(3)卷葉型：葉片邊緣上卷，嚴(yán)重者可形成杯狀。(4)葉片皺縮型：病苗葉片較小，皺縮，葉緣不整齊，甚至扭曲畸形。(5)葉片黃化型：包括葉片黃化及網(wǎng)狀黃脈。薯塊上的癥狀主要是產(chǎn)生黑褐色或黃褐色龜裂紋。病毒病的癥狀可因病毒種類、紅薯品種以及環(huán)境條件等因素的影響而改變，根據(jù)癥狀只能作初步判斷。另外，目測法應(yīng)注意區(qū)分紅薯品種特性以及由于土壤水份多、營養(yǎng)失調(diào)等原因造成的生理病害與病毒病癥狀的差異。6.1.2指示植物法常用巴西牽牛(Ipomoeasetosa)作指示植物，幾乎所有侵染紅薯的病毒都能感染巴西牽牛，因此，將薯苗嫁接在巴西牽牛上，從巴西牽牛的顯癥情況可判斷薯苗是否帶毒。具體嫁接方法如下：以薯苗芽尖作接穗，將芽尖削成楔形，將具3-4片真葉的巴西牽牛作砧木，在其莖中部切一斜口把楔形接穗插入，用封口膜扎住，置防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮陰保濕3-4d，然后在自然光照下觀察記載牽牛的顯癥情況，一般嫁接后25~30d左右開始出現(xiàn)癥狀,顯癥初期新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈，以后發(fā)展為花葉或皺縮等癥狀。6.1.3血清學(xué)檢測常用的血清學(xué)檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附法，它具有快速和能檢測大量樣品的特點，在大量檢測樣品時較常應(yīng)用。具體檢測方法如下：cmgml液，迅速研磨，置于離心管中，取上清液供檢測用。(2)點樣：將NC膜在TBS(20mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,)中充分濕潤，然后放在一張干燥濾紙上，讓其稍事干燥，用鉛筆作好記號，用微量取樣器進行點樣，點樣后(a)封閉:將點樣后的NC膜轉(zhuǎn)入封閉液(TBST+5%脫脂奶粉)中封閉1小時或4℃封閉過夜。夜(b)第一抗體反應(yīng):封閉后的NC膜用TBST(20mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,0.05%Tween-20)漂洗2-3次,每次5-10min,加入用TBST稀釋的病毒?；寡?1:2000)37℃(c)第二抗體反應(yīng):加入TBST稀釋的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:5000),37℃保酯酶緩沖液(100mMTris-HCl,pH9.5,100mMNaCl,5mMMgCL2)中顯色至樣點清晰,將膜放入蒸餾水中漂洗,終止顯色反應(yīng)。取出晾干,拍照。6.2脫毒試管苗種性鑒定法：將脫毒試管苗種植在防蟲網(wǎng)室內(nèi)，每株系種植3株，對照原品種特征特性，剔除變異株系和混雜株系，收獲時檢驗塊根質(zhì)量，與原品種一致的株系進行擴大繁殖。6.3擴繁苗的檢驗隨機抽取1%∽2%脫毒試管苗經(jīng)目測法淘汰弱苗和顯癥苗后，再進行指示植物確認(rèn)，經(jīng)指示植物檢測為不顯癥或為陰性后，方可用于擴繁，若指示植物檢測中有一株為陽性，都不能進行擴繁，還要再進行血清法(酶聯(lián)免疫檢測)不顯癥后，方可用于擴繁。4DB5206/T81－20186.4不同級別脫毒苗的檢測方法6.4.1莖尖苗的檢測莖尖苗的檢測：首先采取目測法淘汰弱苗和顯癥苗(因為脫毒莖尖苗和帶毒莖尖苗在形態(tài)、長勢上有明顯差異，前者生長快、葉片平展、植株較健壯；后者長勢弱，葉片上常出現(xiàn)花葉、明脈和褪綠斑等癥狀)。然后再用血清學(xué)(酶聯(lián)免疫檢測)方法進行篩選，呈陰性的樣品再進行嫁接。每個莖尖苗一般嫁接3-5株，有1株發(fā)病即認(rèn)為該樣品帶病毒，待篩選出都不發(fā)病的樣品才可重復(fù)嫁接。6.4.2原原種田的檢測原原種田的檢測：首先在防蟲網(wǎng)室內(nèi)種植原原種和若干株巴西牽牛，定期觀察巴西牽牛是否顯癥、以判斷是否有蚜蟲傳毒；對原原種田還要進行定期普查，及時淘汰顯癥株和變異株；另外對原原種田要定期取樣，用嫁接指示植物法或酶聯(lián)免疫檢測法進行檢測，以判斷原原種田病毒的感染情況，對于病毒感染率超標(biāo)的繁種田要降級使用。6.4.3原種田的檢測脫毒原種的繁殖要在有一定隔離區(qū)的地方進行，即周圍500m內(nèi)不能種植非脫毒薯。原種田的病毒檢測以目測法和田間種植巴西牽牛為主，必要時田間取樣用酶聯(lián)免疫檢測病毒的感染率。6.4.4生產(chǎn)種田的檢測生產(chǎn)種田的病毒檢測以目測法為主，定期對生產(chǎn)種田的發(fā)病率進行調(diào)查，必要時也可抽樣用酶聯(lián)免疫檢測，當(dāng)發(fā)病率超過一定標(biāo)準(zhǔn)時就不能再作為種薯使用。6.5不同級別脫毒苗的判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)不同級別脫毒苗對病毒感染率的不同要求，初步制定以下判斷標(biāo)準(zhǔn)，病毒感染率超過一定標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)降級使用(見附錄A表A.3)。6.6田間檢驗要求6.6.1詳細(xì)了解受檢單位脫毒紅薯種薯擴繁基地的基本情況，包括基地繁殖面積、隔離情況、海拔高度、種薯來源(有無質(zhì)量報告單)、田間生長情況、品種純度，是否建立生產(chǎn)檔案以及影響種薯質(zhì)量的主要病害類型和發(fā)病率。6.6.2檢驗時間：原原種和原種整個生育期間進行三次檢驗，分別于分枝期、封壟前、收獲前2周。生產(chǎn)用種檢驗二次，分別于封壟前、收獲前2周。檢驗鑒定標(biāo)準(zhǔn)見表1。由繁種單位檢驗，并做好記錄報檢驗部門備案，確需復(fù)查時，由檢驗部門派合格檢驗員復(fù)核檢驗。6.6.3抽樣方法和數(shù)量檢測人員對田間生長的植株作整體觀察后，依據(jù)隨機抽樣法確定抽樣點，其抽樣方法和6.6.4檢驗內(nèi)容紅薯植株的主要病害與純度。6.6.4.1植株的主要病害：檢查典型的病毒病、細(xì)菌與真菌發(fā)病癥狀。其主要發(fā)病癥狀目6.6.4.2純度：檢查品種的植物學(xué)形態(tài)特征：莖的顏色、葉的形態(tài)，薯皮、薯肉顏色，薯5DB5206/T81－2018塊形狀等品質(zhì)，找出雜株。6.6.4.3計算結(jié)果分檢驗項目按以下公式計算6.7脫毒種薯(苗)塊根質(zhì)量檢驗經(jīng)過植株檢驗的種薯(苗)必須進行塊根質(zhì)量檢驗，檢測方法應(yīng)符合塊根抽樣數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)塊根質(zhì)量檢驗抽樣方法：根據(jù)塊根抽樣數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)要求，重點檢測塊根雜質(zhì)、薯塊整齊度、有無缺陷薯、有無細(xì)菌性萎蔫病(紅薯瘟)、有無黑斑病、有無蔓割病、有無根腐病、有無軟腐病、有無鐮刀菌干腐病和腐爛、有無莖線蟲病、有無根結(jié)線蟲病、有無紅薯蟻象以及能表現(xiàn)該品種特征特性的種薯純度，并將各種測定結(jié)果換算成百分率。7判定規(guī)則7.1脫毒種薯(苗)分級以繁殖田播種的種薯級別、帶病植株比率、混雜植株比率為定級標(biāo)準(zhǔn)。7.2病毒病、蔓割病、黑斑病、莖線蟲病、瘡痂病以及混雜植株比率六項質(zhì)量指標(biāo)，任何一項不符合原來級別質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)但又高于下一級別質(zhì)量指標(biāo)者，判定結(jié)果均按降低一級定級別，只要檢出根腐病、根結(jié)線蟲病、紅薯瘟、紅薯蟻象，皆不能作種用。注：各種病害癥狀7.3經(jīng)田間植株檢驗和塊根質(zhì)量檢驗合格后，簽發(fā)紅薯脫毒種薯質(zhì)量合格證書見附錄A表A.8。6DB5206/T81－2018(資料性附錄)標(biāo)準(zhǔn)中的記錄表表A.1各級別脫毒種薯(苗)繁殖田中帶病植株允許率表A.1各級別脫毒種薯(苗)繁殖田中帶病植株允許率檢驗時期種薯級別病害及混雜株率(%)病毒病紅薯瘟根腐病根結(jié)線蟲病紅薯蟻象黑斑病瘡痂病蔓割病莖線蟲病混雜株率分枝期檢驗育種家種子0000000000原原種0000000000原種≤5.00000≤5.00≤1.00≤1.0生產(chǎn)用種≤10.00000≤8.0≤5.0≤2.0≤1.0≤4.0封壟前檢驗育種家種子0000000000原原種0000000000原種≤3.00000≤3.00≤1.00≤0.5生產(chǎn)用種≤10.00000≤5.0≤3.0≤2.0≤1.0≤2.0收獲周檢驗育種家種子0000000000原原種0000000000原種≤2.00000≤1.00≤1.00≤0.5生產(chǎn)用種≤10.00000≤2.0≤1.0≤2.0≤1.0≤2.0注：種苗質(zhì)量應(yīng)符合分枝期檢驗質(zhì)量指標(biāo)。7DB5206/T81－2018表A.2各級別脫毒種薯塊根質(zhì)量指標(biāo)表A.2各級別脫毒種薯塊根質(zhì)量指標(biāo)項目允許率(%)育種家種子原原種原種生產(chǎn)用種純度100.0100.0＞99.5＞98.0薯塊整齊度≥90.0≥90.0≥85.0≥85.0有缺陷薯≤1.0≤1.0≤3.0≤5.0雜質(zhì)≤1.0＜2.0＜2.0＜2.0軟腐病000＜1.0黑斑病00≤1.0≤2.0莖線蟲病000≤1.0根結(jié)線蟲病0000紅薯蟻象0000根腐病0000紅薯瘟0000表A.3紅薯脫毒苗病毒檢測方法及判定標(biāo)準(zhǔn)(試行)表A.3紅薯脫毒苗病毒檢測方法及判定標(biāo)準(zhǔn)(試行)種苗級別檢測方法取樣方法檢樣數(shù)量重復(fù)次數(shù)判斷依據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)備注試管苗a.血清法(酶聯(lián)免疫檢測)b.指示植物法試管苗2a.血清學(xué)檢測b.嫁接所有重復(fù)均不顯癥為0原原種苗b.血清法c.指示植物法樣普查2嫁接不顯癥或血清反應(yīng)陰性目測顯癥率為0；血清及指示植物陽性率小用目測顯癥率大用于0.1%者可降級為原種使。原種苗b.血清法c.指示植物法樣多點普查2目測顯癥率小指示植物陽性率小于1%.用顯癥率大于用1.0%者可降級為生產(chǎn)種使。生產(chǎn)種苗b.血清法隨機多點取樣3-5依癥狀判斷目測顯癥率小8DB5206/T81－2018表A.4育種家種子、原原種和原種不同面積田塊的檢驗點數(shù)和植株數(shù)表A.4育種家種子、原原種和原種不同面積田塊的檢驗點數(shù)和植株數(shù)檢驗點數(shù)和每點檢驗植株數(shù)≤0.10.11~1每個點100株，超過1hm劃出另一檢驗區(qū)，按本檢驗標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的不同面積的檢驗點取樣。表A.5生產(chǎn)用種不同面積田塊的檢驗點數(shù)和植株數(shù)表5生產(chǎn)用種不同面積田塊的檢驗點數(shù)和植株數(shù)面積，hm檢驗點數(shù)和每點檢驗植株數(shù)≤0.10.11~11.1~5株。隨機抽樣檢驗10個點，每個點100株，超過5hm劃出另一檢驗區(qū)，按本檢驗標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的不同面積的檢驗點取樣。表A.6檢驗記錄表A.6檢驗記錄：檢驗日期：年月日觀察記載項目各類病株數(shù)檢驗員(簽字)備注細(xì)菌性萎蔫病黑斑病瘡痂病蔓割病根腐病根結(jié)線蟲病莖線蟲病軟腐病鐮刀菌干腐病紅薯蟻象12345合計%9DB5206/T81－2018表A.7脫毒種薯塊根抽樣數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)表表A.7脫毒種薯塊根抽樣數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)表種類總量抽樣百分率%抽樣最低數(shù)量種薯≤10000kg＞10000kg6~103~5100kg注：不足抽樣最低數(shù)量的全部作為混合樣品。表A.8紅薯脫毒種薯質(zhì)量檢驗合格證書表A.8紅薯脫毒種薯質(zhì)量檢驗合格證書年月日紅薯脫毒種薯質(zhì)量檢驗合格證書編號：種薯生產(chǎn)單位：種薯級別：品種名稱：上述種薯經(jīng)按銅仁市地方標(biāo)準(zhǔn)(DB5222/T83-2018《紅薯脫毒種薯檢驗規(guī)程》)檢驗合格，特發(fā)此證。檢驗人：檢驗機關(guān)：(簽字)(印章)表A.9紅薯種薯(苗)田間帶病植株癥狀表A.9紅薯種薯(苗)田間帶病植株癥狀病害名稱植株塊根細(xì)菌性萎蔫病(紅薯瘟)從育苗至結(jié)薯均能發(fā)病。晴天中午，病苗頂部葉片萎蔫，莖基黑褐色水爛癥狀，維管束從下而上黃褐色條紋癥狀，嚴(yán)重時莖內(nèi)全部腐爛，成株發(fā)病，葉色暗淡無光澤，蔓出現(xiàn)水漬癥狀斑點且呈黑褐色，剖視維管束，褐色條紋用手拉易脫皮，留下纖維。輕病薯塊乳汁明顯減少，有苦臭味，煮不爛，外表癥狀常不明顯，僅薯蒂附近呈黑褐色或尾根呈不同程度病變，剖開橫切面為分散的小斑點或黃褐色至深褐色斑塊，重癥薯塊，整塊呈黑褐色腐爛或一端腐爛，有膿液狀或淡黃色菌液，臭味很重。黑斑病莖基部形成黑褐色梭形或橢圓形病斑，病斑初期有灰色霉層，后變成黑色粉狀物，病斑逐漸擴大，重者基部全部變黑至枯死。薯塊上形成黑色圓形病斑，病部輪廓清晰，組織堅實，薯肉呈青褐色或黑褐色，有苦味和強烈的臭味，病部木栓化，堅硬、干腐，在適當(dāng)條件下病斑中央會長出黑色子囊殼。瘡痂病葉片卷皺、嫩芽僵縮，莖蔓和葉柄生出無數(shù)凹凸不平的粗糙病斑，頂芽受害病斑初為透明深紅色，擴大后逐漸變黑呈褐色而枯死，新梢和幼葉不能長大，整個頂梢收縮僵硬而直立，表現(xiàn)粗糙。不表現(xiàn)癥狀DB5206/T81－2018表A.9紅薯種薯(苗)田間帶病植株癥狀(續(xù))病害名稱植株塊根莖線蟲病苗期：發(fā)病重的出苗少、矮小、發(fā)黃，剖視莖基部，內(nèi)有褐色空隙，剪斷后不流或流出的白漿狠少，后期侵入部位表皮形成小口，剪斷后無白漿。莖蔓癥