無菌及微生物檢查方法驗(yàn)證

無菌檢查及微生物檢查方法

介紹內(nèi)容

一、微生物的基礎(chǔ)知識(shí)二、無菌檢查方法

微生物基礎(chǔ)知識(shí)

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見的微小生物的總稱。微生物（microorganism）包括細(xì)菌、支原體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌（霉菌、酵母菌和放線菌）等。

細(xì)菌（bacterium）屬于原核細(xì)胞型微生物，其特點(diǎn)是具有細(xì)胞壁、原始的核質(zhì)，以二分裂方式繁殖。

細(xì)菌的形態(tài)

⒈細(xì)菌體積微小，是無色半透明的，用肉眼直接觀察難以看到，其結(jié)構(gòu)和形狀須經(jīng)過顯微鏡放大數(shù)百倍至上千倍才能觀察。⒉一般以微米（μm）作為測(cè)量單位。⒊在細(xì)菌學(xué)中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌和螺桿菌。⒋經(jīng)革蘭染色法（Gramstain）可將細(xì)菌分成兩大類：即革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）。

真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和細(xì)胞壁的生物。種類很多，已報(bào)道的種超過10萬個(gè)。大多是由纖細(xì)管狀菌絲構(gòu)成的菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在基質(zhì)上生長的形態(tài)稱為菌落。

真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光學(xué)顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細(xì)胞、多細(xì)胞，單細(xì)胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（yeast）。多細(xì)胞由菌絲和孢子組成，并交織成團(tuán)。

藥品污染常見的真菌

毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬一、毛霉屬（MucorMicheliexFries）

毛霉屬在自然界分布很廣，常用于發(fā)酵工業(yè)。并引起水分高的糧食及食品的霉?fàn)€變質(zhì)。

根霉屬（RhizopusEhrenberg）

根霉屬廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕的糧食及食品上能迅速蔓延生長，引起糧食及食品的腐爛。曲霉屬（Aspergillus）

曲霉屬的菌絲無色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔的多細(xì)胞。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有8個(gè)種，具有強(qiáng)烈的致癌性。

青霉屬菌絲無色或有色，為有隔的多細(xì)胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細(xì)胞，頂端不膨大，無頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最后一級(jí)分枝的小梗上，長出成串的分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有9個(gè)種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一種神經(jīng)毒素，并具有致畸、致突變和致癌性；

霉菌菌落形態(tài)

霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)

酵母菌顯微鏡下形態(tài)

無菌檢查法

無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。

無菌保障

試驗(yàn)環(huán)境

檢驗(yàn)依據(jù)

隔離系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的目的⒈是保護(hù)產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，保證無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)一次檢出的要求。⒉是保護(hù)操作人員免受實(shí)驗(yàn)過程中的有害物質(zhì)帶來的污染。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)還需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。

培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

改良馬丁培養(yǎng)基0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基

制備培養(yǎng)特基的要求⒈培養(yǎng)耀基的裝堡量與容控器高度招的比例值應(yīng)符合銀培養(yǎng)結(jié)束后培皂養(yǎng)基氧軌化層（辮粉紅色旬）不超紗過培養(yǎng)宗基深度艦1/2望。⒉培養(yǎng)奮基氧化謊層顏色餃不得超戀過培養(yǎng)男基深度掀的1/破5，否應(yīng)則，須候經(jīng)10泳0℃水鴉浴加熱泳至粉紅廊色消失華（不超尼過20短分鐘）楊，迅速土冷卻，那只限加售熱一次想。⒊配制唐好的培帥養(yǎng)基應(yīng)帖采用驗(yàn)翻證合格咸的滅菌瘦程序滅揀菌。培養(yǎng)基頸的貯存制備好的籠培養(yǎng)基應(yīng)帖在2-2李5℃、避玻光保存；收保存萍在非密容徹器中，應(yīng)敘在3周內(nèi)狼使用；保核存在密閉增容器中，株可在1年慰內(nèi)使用。培養(yǎng)基翼的適用挎性檢查無菌性租檢查每批培擔(dān)養(yǎng)基隨撐機(jī)取不掏少于5碼支，培漫養(yǎng)14劣天應(yīng)無刃菌生長易。試驗(yàn)展可與無四菌試驗(yàn)顫同時(shí)進(jìn)輝行。靈敏度檢卡查菌慶種菌液制備黑曲霉醋菌液的閑制備培養(yǎng)克基接貸種參照中顯國藥典純201再0版結(jié)果判斷空白對(duì)照或應(yīng)無菌生像長，若加趟菌的培養(yǎng)濾基管均生掉長良好，愁判該培養(yǎng)飾基的靈敏腥度檢查符暈合規(guī)定。試驗(yàn)同時(shí)坐應(yīng)做空白患對(duì)照稀釋液、虎沖洗液0.1%專蛋白胨水砍溶液pH7揀.0氯判化鈉-誰蛋白胨殊緩沖液根據(jù)供試般品的特性躁，可選用課其他經(jīng)驗(yàn)盞證過的適蹄宜的溶液秧作為稀釋領(lǐng)液、沖洗劈燕液。如需要尋，可在蹈上述稀甩釋液或繩沖洗液狼的滅菌鴨前或滅控菌后加貴入表面庸活性劑細(xì)或中和串劑等。陽性對(duì)照根據(jù)供泡試品特嬌性選擇漲陽性對(duì)踐照菌：無抑菌百作用及茅抗革蘭俘陽性菌抗革蘭陰匪性菌抗厭氧菌抗真菌加菌量結(jié)果判斷陰性對(duì)提照供試品揮無菌檢呀查時(shí)，析應(yīng)取相承應(yīng)溶劑登和稀釋咸液、沖頸洗液同清法操作莫，作為斬陰性對(duì)托照。陰蓬性對(duì)照丑不得有涼菌生長露。無菌檢鼓查法包括薄膜練過濾法和花直接接種綢法。只要供試非品性狀允弱許，應(yīng)采御用薄膜過紫濾法。薄膜過濾披法過濾器養(yǎng)應(yīng)優(yōu)先底選擇封虹閉式薄比膜過濾證也可使沿用一般毫薄膜過折濾器。選擇濾膜從材質(zhì)時(shí)應(yīng)幼考慮供試捏品及其溶頭劑的特性犬。⒈可溶于養(yǎng)十四烷酸隙異丙酯的夫膏劑和黏芬性油劑供卡試品。⒉水溶性供試品直司接過濾。⒊可溶卵性固體枯制劑供拜試品。⒋裝有藥物錢的注射器供試品廳和具有驚導(dǎo)管的營醫(yī)療器馳具的供烘試品。直接接掠種法供試品沙按規(guī)定鴉量分別幟接入含環(huán)培養(yǎng)細(xì)份菌和真賠菌培養(yǎng)共基的容追器中，溫除另有英規(guī)定外訊，每個(gè)循容器中榨的培養(yǎng)駝基量應(yīng)菠符合接神種的供中試品體斜積不得經(jīng)大于培填養(yǎng)基體究積的1壯0%。階同時(shí)硫脆乙醇店酸鹽培都養(yǎng)基不很得少于泊15m棍l、改險(xiǎn)良馬丁疑培養(yǎng)基甚不得少搏于10建ml，堂培養(yǎng)基投用量和頌高度應(yīng)戶經(jīng)方法道驗(yàn)證。培養(yǎng)及觀痰察培養(yǎng)14每天，如果餡培養(yǎng)基渾懲濁或培養(yǎng)拳14天后仆從外觀不洪能判斷是脂否長菌，塌可取該培虛養(yǎng)液適量放轉(zhuǎn)種至同銷種培養(yǎng)基靈或斜面上齡，培養(yǎng)細(xì)剩菌2天、嬸真菌3天飼，觀察有飯無菌生長集或鏡檢進(jìn)膜行判斷。陰性對(duì)倉照不得教有菌生惑長。結(jié)果判斷⒈若供試攤品管均澄鑄清，或雖蹤蝶顯渾濁無饑菌生長，典判供試品屆符合規(guī)定布。⒉若供脂試品中汽任何1學(xué)管顯混求濁并確要證有生考長供試?yán)逼凡环骱弦?guī)定性。⒊除非能挽充分證明僑，檢出的筍微生物非甘供試品所寬含。⒋當(dāng)符合銅下列至少晃一個(gè)條件恰時(shí)，方可扭判復(fù)試。⑴對(duì)瘡無菌檢售查試驗(yàn)抽所用的所設(shè)備及右環(huán)境的億微生物楚監(jiān)控結(jié)忌果不符灣合無菌飼檢查法土的要求鎖。⑵回軍顧無菌振實(shí)驗(yàn)過餡程，發(fā)撫現(xiàn)有可下能引起才微生物思污染的舅因素；⑶陰性及對(duì)照管有旋菌生長。⑷供廉試品管漸中生長手的微生五物經(jīng)鑒消定后，緒確證微除生物生普長是因爺無菌試崖驗(yàn)中所爪使用的當(dāng)物品和潛（或）飯無菌操貓作技術(shù)些不當(dāng)引悅起的。⑸試驗(yàn)炊若經(jīng)確嗎認(rèn)無效易，應(yīng)重鏟試。重墾試時(shí)，曠重新取接同量供奸試品，圈依法重稻試，若筆無菌生礦長，判慘供試品腦符合規(guī)沖定，若威有菌生竟長判供關(guān)試品不包符合規(guī)班定。方法驗(yàn)匹證的必憤要性⒈為保奏證檢驗(yàn)稅結(jié)果的拋可靠性起，真實(shí)師性，選綱擇正確痰的檢驗(yàn)貧方法是籌至關(guān)重勞要的。愚因此試負(fù)驗(yàn)前必稀須對(duì)選燙擇的方老法進(jìn)行終驗(yàn)證。⒉證明熄所采用箱的方法躍是適宜前的，確仔認(rèn)所采購用的方蘋法適宜些于被檢魂供試品庸的微生建物污染露的檢驗(yàn)趕。藥品無腳菌檢查幕和微生緒物檢查踐方法驗(yàn)塔證檢驗(yàn)結(jié)果慘的影響因驢素⒈供試重品的組伴分⒉環(huán)境影蜻響⒊檢驗(yàn)截方法⒋檢驗(yàn)條福件⒈我國無泊菌和微生嶼物檢驗(yàn)方牽法驗(yàn)證的尿概況

⒉五國外無菌蠢和微生物屋檢驗(yàn)方法刷驗(yàn)證的概蟻況

⒊國圖外無菌和適微生物檢啞驗(yàn)方法驗(yàn)姐證的概況藥品微生五物檢驗(yàn)方風(fēng)法驗(yàn)證的須基本要求驗(yàn)證試驗(yàn)沉的設(shè)計(jì)需集綜合全面公考慮，主瞞要有以下年幾方面；⑴供試品授特性⑵檢驗(yàn)?zāi)康蘑窃囼?yàn)全方場(chǎng)面驗(yàn)證當(dāng)驗(yàn)證試盈驗(yàn)符合要握求時(shí)，就撐可認(rèn)為在蠟該試驗(yàn)條休件下該供帳試品對(duì)微盞生物無抑過菌作用或豪抑菌作用蹦可忽略不奔計(jì)，供試豈品檢驗(yàn)結(jié)啦果可真實(shí)棟的體現(xiàn)。⑷重厚新驗(yàn)證藥品的番生產(chǎn)工扶藝、制插劑組分嚼、檢驗(yàn)纖方法或其檢驗(yàn)條都件發(fā)生裂改變時(shí)栗，應(yīng)重仔新進(jìn)行策驗(yàn)證，征以確認(rèn)躬所發(fā)生街的變化邪不影響蓮該藥品太中的微述生物檢道查。驗(yàn)證試驗(yàn)身用菌株的雅要求⑴驗(yàn)證件試驗(yàn)用泉菌株應(yīng)恥有代表很性。⑵試驗(yàn)梨菌株應(yīng)廟選擇非碗致病性呀菌株。⑶試驗(yàn)菌宜爛選擇比較雁穩(wěn)定、重?zé)衄F(xiàn)性強(qiáng)的飛菌株。⑷菌株等傳代次麻數(shù)不得李超過第暮五代。試驗(yàn)用周菌株的采儲(chǔ)藏菌種保巨藏的原籃則根據(jù)微生昌物菌種的券生理、生風(fēng)化特性，瓦在人工創(chuàng)燃造的條件圍下盡量降略低微生物偷細(xì)胞的代泛謝強(qiáng)度，僵使細(xì)胞基臨本上處于夾休眠狀態(tài)猾，生長繁丑殖受到抑荒制但不至貢于死亡，匆以減低菌擾種的變異劉率。標(biāo)準(zhǔn)菌飄株的復(fù)姻活或培吳養(yǎng)物的卷制備應(yīng)柿按供應(yīng)卻商提供巧的說明擱或按驗(yàn)角證的方得法進(jìn)行伍。低溫、干趨燥、缺氧瓶、缺乏營害養(yǎng)等環(huán)境劈燕條件都可絨以抑制微生華物的代謝乏和生長繁村殖，因此暖低溫、干猜燥和認(rèn)真空是菌尖種保藏的旅重要手段覺。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備爆菌株經(jīng)純民度和特性鴉確認(rèn)后保經(jīng)存時(shí)，可助將培養(yǎng)物等朝份懸浮于有抗冷凍的慶培養(yǎng)基中襯，并分裝澡于小質(zhì)瓶中,建奶議采用低位溫冷凍干沫燥，液氮型儲(chǔ)存，摩超低添溫冷凍(為低于-7制0℃)等拉方法保存佳。冷凍菌性株一旦統(tǒng)解凍轉(zhuǎn)買種制備數(shù)工作菌島株后,見不得重燥新冷凍邊或再次述使用。工作菌株獨(dú)不可代替苗標(biāo)準(zhǔn)菌株家，標(biāo)準(zhǔn)菌耍株的商業(yè)刑衍生物僅欠可用作工素作菌株。不同的鑼微生物獵，應(yīng)根膨據(jù)其生反物特征幻玉來選擇脊最適宜教的保藏炮方法，唐菌種的血保藏方亦法一般憑分四個(gè)評(píng)階段：⑴

挑贏選特征院典型的榜純菌菌進(jìn)落。⑵確定保辦藏的合適劍菌體形態(tài)具。⑶選擇最圓適宜的方爽法保藏。⑷定期對(duì)觀保藏的菌宰種進(jìn)行檢植查。菌種的陪傳代和匆使用工作菌痛種的傳偵代次數(shù)羽應(yīng)嚴(yán)格噸控制，持不得超嚇過5葉代，（族從菌種輪保藏中在心獲得抽的標(biāo)準(zhǔn)滾菌株為蒜第0代騎）她防止魂