無菌及微生物檢查方法驗證

無菌檢查及微生物檢查方法

介紹內(nèi)容

一、微生物的基礎知識二、無菌檢查方法

微生物基礎知識

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見的微小生物的總稱。微生物（microorganism）包括細菌、支原體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌（霉菌、酵母菌和放線菌）等。

細菌（bacterium）屬于原核細胞型微生物，其特點是具有細胞壁、原始的核質(zhì)，以二分裂方式繁殖。

細菌的形態(tài)

⒈細菌體積微小，是無色半透明的，用肉眼直接觀察難以看到，其結(jié)構和形狀須經(jīng)過顯微鏡放大數(shù)百倍至上千倍才能觀察。⒉一般以微米（μm）作為測量單位。⒊在細菌學中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌和螺桿菌。⒋經(jīng)革蘭染色法（Gramstain）可將細菌分成兩大類：即革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）。

真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和細胞壁的生物。種類很多，已報道的種超過10萬個。大多是由纖細管狀菌絲構成的菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在基質(zhì)上生長的形態(tài)稱為菌落。

真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光學顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細胞、多細胞，單細胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（yeast）。多細胞由菌絲和孢子組成，并交織成團。

藥品污染常見的真菌

毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬一、毛霉屬（MucorMicheliexFries）

毛霉屬在自然界分布很廣，常用于發(fā)酵工業(yè)。并引起水分高的糧食及食品的霉爛變質(zhì)。

根霉屬（RhizopusEhrenberg）

根霉屬廣泛應用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕的糧食及食品上能迅速蔓延生長，引起糧食及食品的腐爛。曲霉屬（Aspergillus）

曲霉屬的菌絲無色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔的多細胞。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有8個種，具有強烈的致癌性。

青霉屬菌絲無色或有色，為有隔的多細胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細胞，頂端不膨大，無頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最后一級分枝的小梗上，長出成串的分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有9個種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一種神經(jīng)毒素，并具有致畸、致突變和致癌性；

霉菌菌落形態(tài)

霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)

酵母菌顯微鏡下形態(tài)

無菌檢查法

無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。

無菌保障

試驗環(huán)境

檢驗依據(jù)

隔離系統(tǒng)的應用

應用隔離系統(tǒng)重要的目的⒈是保護產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，保證無菌實驗結(jié)果的可靠性，實現(xiàn)一次檢出的要求。⒉是保護操作人員免受實驗過程中的有害物質(zhì)帶來的污染。隔離系統(tǒng)應按相關的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。

培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

改良馬丁培養(yǎng)基0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基

制備培養(yǎng)特基的要求⒈培養(yǎng)耀基的裝堡量與容控器高度招的比例值應符合銀培養(yǎng)結(jié)束后培皂養(yǎng)基氧軌化層（辮粉紅色旬）不超紗過培養(yǎng)宗基深度艦1/2望。⒉培養(yǎng)奮基氧化謊層顏色餃不得超戀過培養(yǎng)男基深度掀的1/破5，否應則，須候經(jīng)10泳0℃水鴉浴加熱泳至粉紅廊色消失華（不超尼過20短分鐘）楊，迅速土冷卻，那只限加售熱一次想。⒊配制唐好的培帥養(yǎng)基應帖采用驗翻證合格咸的滅菌瘦程序滅揀菌。培養(yǎng)基頸的貯存制備好的籠培養(yǎng)基應帖在2-2李5℃、避玻光保存；收保存萍在非密容徹器中，應敘在3周內(nèi)狼使用；保核存在密閉增容器中，株可在1年慰內(nèi)使用。培養(yǎng)基翼的適用挎性檢查無菌性租檢查每批培擔養(yǎng)基隨撐機取不掏少于5碼支，培漫養(yǎng)14劣天應無刃菌生長易。試驗展可與無四菌試驗顫同時進輝行。靈敏度檢卡查菌慶種菌液制備黑曲霉醋菌液的閑制備培養(yǎng)克基接貸種參照中顯國藥典純201再0版結(jié)果判斷空白對照或應無菌生像長，若加趟菌的培養(yǎng)濾基管均生掉長良好，愁判該培養(yǎng)飾基的靈敏腥度檢查符暈合規(guī)定。試驗同時坐應做空白患對照稀釋液、虎沖洗液0.1%專蛋白胨水砍溶液pH7揀.0氯判化鈉-誰蛋白胨殊緩沖液根據(jù)供試般品的特性躁，可選用課其他經(jīng)驗盞證過的適蹄宜的溶液秧作為稀釋領液、沖洗劈燕液。如需要尋，可在蹈上述稀甩釋液或繩沖洗液狼的滅菌鴨前或滅控菌后加貴入表面庸活性劑細或中和串劑等。陽性對照根據(jù)供泡試品特嬌性選擇漲陽性對踐照菌：無抑菌百作用及茅抗革蘭俘陽性菌抗革蘭陰匪性菌抗厭氧菌抗真菌加菌量結(jié)果判斷陰性對提照供試品揮無菌檢呀查時，析應取相承應溶劑登和稀釋咸液、沖頸洗液同清法操作莫，作為斬陰性對托照。陰蓬性對照丑不得有涼菌生長露。無菌檢鼓查法包括薄膜練過濾法和花直接接種綢法。只要供試非品性狀允弱許，應采御用薄膜過紫濾法。薄膜過濾披法過濾器養(yǎng)應優(yōu)先底選擇封虹閉式薄比膜過濾證也可使沿用一般毫薄膜過折濾器。選擇濾膜從材質(zhì)時應幼考慮供試捏品及其溶頭劑的特性犬。⒈可溶于養(yǎng)十四烷酸隙異丙酯的夫膏劑和黏芬性油劑供卡試品。⒉水溶性供試品直司接過濾。⒊可溶卵性固體枯制劑供拜試品。⒋裝有藥物錢的注射器供試品廳和具有驚導管的營醫(yī)療器馳具的供烘試品。直接接掠種法供試品沙按規(guī)定鴉量分別幟接入含環(huán)培養(yǎng)細份菌和真賠菌培養(yǎng)共基的容追器中，溫除另有英規(guī)定外訊，每個循容器中榨的培養(yǎng)駝基量應菠符合接神種的供中試品體斜積不得經(jīng)大于培填養(yǎng)基體究積的1壯0%。階同時硫脆乙醇店酸鹽培都養(yǎng)基不很得少于泊15m棍l、改險良馬丁疑培養(yǎng)基甚不得少搏于10建ml，堂培養(yǎng)基投用量和頌高度應戶經(jīng)方法道驗證。培養(yǎng)及觀痰察培養(yǎng)14每天，如果餡培養(yǎng)基渾懲濁或培養(yǎng)拳14天后仆從外觀不洪能判斷是脂否長菌，塌可取該培虛養(yǎng)液適量放轉(zhuǎn)種至同銷種培養(yǎng)基靈或斜面上齡，培養(yǎng)細剩菌2天、嬸真菌3天飼，觀察有飯無菌生長集或鏡檢進膜行判斷。陰性對倉照不得教有菌生惑長。結(jié)果判斷⒈若供試攤品管均澄鑄清，或雖蹤蝶顯渾濁無饑菌生長，典判供試品屆符合規(guī)定布。⒉若供脂試品中汽任何1學管顯混求濁并確要證有生考長供試辣品不符恩合規(guī)定性。⒊除非能挽充分證明僑，檢出的筍微生物非甘供試品所寬含。⒋當符合銅下列至少晃一個條件恰時，方可扭判復試。⑴對瘡無菌檢售查試驗抽所用的所設備及右環(huán)境的億微生物楚監(jiān)控結(jié)忌果不符灣合無菌飼檢查法土的要求鎖。⑵回軍顧無菌振實驗過餡程，發(fā)撫現(xiàn)有可下能引起才微生物思污染的舅因素；⑶陰性及對照管有旋菌生長。⑷供廉試品管漸中生長手的微生五物經(jīng)鑒消定后，緒確證微除生物生普長是因爺無菌試崖驗中所爪使用的當物品和潛（或）飯無菌操貓作技術些不當引悅起的。⑸試驗炊若經(jīng)確嗎認無效易，應重鏟試。重墾試時，曠重新取接同量供奸試品，圈依法重稻試，若筆無菌生礦長，判慘供試品腦符合規(guī)沖定，若威有菌生竟長判供關試品不包符合規(guī)班定。方法驗匹證的必憤要性⒈為保奏證檢驗稅結(jié)果的拋可靠性起，真實師性，選綱擇正確痰的檢驗貧方法是籌至關重勞要的。愚因此試負驗前必稀須對選燙擇的方老法進行終驗證。⒉證明熄所采用箱的方法躍是適宜前的，確仔認所采購用的方蘋法適宜些于被檢魂供試品庸的微生建物污染露的檢驗趕。藥品無腳菌檢查幕和微生緒物檢查踐方法驗塔證檢驗結(jié)果慘的影響因驢素⒈供試重品的組伴分⒉環(huán)境影蜻響⒊檢驗截方法⒋檢驗條福件⒈我國無泊菌和微生嶼物檢驗方牽法驗證的尿概況

⒉五國外無菌蠢和微生物屋檢驗方法刷驗證的概蟻況

⒊國圖外無菌和適微生物檢啞驗方法驗姐證的概況藥品微生五物檢驗方風法驗證的須基本要求驗證試驗沉的設計需集綜合全面公考慮，主瞞要有以下年幾方面；⑴供試品授特性⑵檢驗目的⑶試驗全方場面驗證當驗證試盈驗符合要握求時，就撐可認為在蠟該試驗條休件下該供帳試品對微盞生物無抑過菌作用或豪抑菌作用蹦可忽略不奔計，供試豈品檢驗結(jié)啦果可真實棟的體現(xiàn)。⑷重厚新驗證藥品的番生產(chǎn)工扶藝、制插劑組分嚼、檢驗纖方法或其檢驗條都件發(fā)生裂改變時栗，應重仔新進行策驗證，征以確認躬所發(fā)生街的變化邪不影響蓮該藥品太中的微述生物檢道查。驗證試驗身用菌株的雅要求⑴驗證件試驗用泉菌株應恥有代表很性。⑵試驗梨菌株應廟選擇非碗致病性呀菌株。⑶試驗菌宜爛選擇比較雁穩(wěn)定、重燈現(xiàn)性強的飛菌株。⑷菌株等傳代次麻數(shù)不得李超過第暮五代。試驗用周菌株的采儲藏菌種保巨藏的原籃則根據(jù)微生昌物菌種的券生理、生風化特性，瓦在人工創(chuàng)燃造的條件圍下盡量降略低微生物偷細胞的代泛謝強度，僵使細胞基臨本上處于夾休眠狀態(tài)猾，生長繁丑殖受到抑荒制但不至貢于死亡，匆以減低菌擾種的變異劉率。標準菌飄株的復姻活或培吳養(yǎng)物的卷制備應柿按供應卻商提供巧的說明擱或按驗角證的方得法進行伍。低溫、干趨燥、缺氧瓶、缺乏營害養(yǎng)等環(huán)境劈燕條件都可絨以抑制微生華物的代謝乏和生長繁村殖，因此暖低溫、干猜燥和認真空是菌尖種保藏的旅重要手段覺。標準儲備爆菌株經(jīng)純民度和特性鴉確認后保經(jīng)存時，可助將培養(yǎng)物等朝份懸浮于有抗冷凍的慶培養(yǎng)基中襯，并分裝澡于小質(zhì)瓶中,建奶議采用低位溫冷凍干沫燥，液氮型儲存，摩超低添溫冷凍(為低于-7制0℃)等拉方法保存佳。冷凍菌性株一旦統(tǒng)解凍轉(zhuǎn)買種制備數(shù)工作菌島株后,見不得重燥新冷凍邊或再次述使用。工作菌株獨不可代替苗標準菌株家，標準菌耍株的商業(yè)刑衍生物僅欠可用作工素作菌株。不同的鑼微生物獵，應根膨據(jù)其生反物特征幻玉來選擇脊最適宜教的保藏炮方法，唐菌種的血保藏方亦法一般憑分四個評階段：⑴

挑贏選特征院典型的榜純菌菌進落。⑵確定保辦藏的合適劍菌體形態(tài)具。⑶選擇最圓適宜的方爽法保藏。⑷定期對觀保藏的菌宰種進行檢植查。菌種的陪傳代和匆使用工作菌痛種的傳偵代次數(shù)羽應嚴格噸控制，持不得超嚇過5葉代，（族從菌種輪保藏中在心獲得抽的標準滾菌株為蒜第0代騎）她防止魂