DB51T 2964-2022口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

DB51Technicalstandardformonitoringthepinewoodnem四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布 本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件起草單位：成都海關(guān)技術(shù)中心、寧波海關(guān)技術(shù)中口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范驗(yàn)室檢測(cè)、監(jiān)測(cè)樣品的保存及處理、監(jiān)測(cè)結(jié)果GB/T23476-2009松材線蟲(chóng)病檢疫技術(shù)GB/T23478松材線蟲(chóng)普查監(jiān)測(cè)SN/T1724-2006進(jìn)境針葉樹(shù)原木、木制品和木質(zhì)包裝材料中松材線蟲(chóng)的檢SN/T4350-2015旅客攜帶物和郵寄物檢疫鑒定寄生滑刃亞科（Parasitaphelenchinae），傘滑刃屬（Bursaphelenchus），能引起松樹(shù)萎蔫病，是針葉樹(shù)木上最重要的病原生物之一。松材線蟲(chóng)相關(guān)信息參松褐天牛MonochamusalternatusHope,1843又名松墨天牛、松天牛，屬于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是為害松樹(shù)云杉花墨天牛MonochamussaltuariusGebler,1830又名云杉花黑天牛，屬于天?？疲–erambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是一種蛀干性昆未經(jīng)過(guò)干燥、化學(xué)防腐劑等處理，并未永久改變其松木及其制品pinewoodandwoodenw木質(zhì)包裝材料woodpackingma色物將胞壁染色，促使木材藍(lán)變的現(xiàn)象。藍(lán)變是判斷松材線蟲(chóng)監(jiān)測(cè)抽樣的一個(gè)重海關(guān)指定監(jiān)管場(chǎng)地customsdesignatedsupervisio高風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)植物及其產(chǎn)品實(shí)施查驗(yàn)、檢驗(yàn)、檢海關(guān)監(jiān)管貨物cargounderc減免稅貨物，以及暫時(shí)進(jìn)出口貨物、保稅貨物和4監(jiān)測(cè)范圍墊材料、運(yùn)輸工具、郵寄物及旅客攜帶物。松材線蟲(chóng)的寄主植物范圍參見(jiàn)附錄A.牙以及中國(guó)臺(tái)灣等國(guó)家或地區(qū)的松木及其制品、郵寄物及旅客攜重點(diǎn)抽取材質(zhì)干燥無(wú)松脂香味、有藍(lán)變、有媒樣品標(biāo)識(shí)信息應(yīng)完整、清晰，確?？伤菰?、可追查，規(guī)范填寫(xiě)附錄表B），照GB/T23476-2009中附錄C執(zhí)行。分離時(shí)室內(nèi)溫度應(yīng)保持在20℃~30℃之間，或置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)以避免漏檢轉(zhuǎn)移到載玻片上，液滴體積50μL左右為宜。在酒精燈上以1s左右的頻率通過(guò)8次~測(cè)量并計(jì)算體長(zhǎng)/蟲(chóng)體最寬處體寬（a）、體長(zhǎng)/尾長(zhǎng)（c）、尾長(zhǎng)/肛門(mén)處體寬（c’）等值。如樣品足夠，應(yīng)測(cè)量雄蟲(chóng)、雄蟲(chóng)各20條以上。測(cè)計(jì)方法參考SN/T27按照SN/T1132-2002中附錄C.2松材線蟲(chóng)特異PCR檢測(cè)見(jiàn)附錄E，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)見(jiàn)附錄F，DNA條形碼鑒定見(jiàn)分子生物學(xué)檢測(cè)依據(jù)附錄E～附錄G相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行判定，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的可鑒定復(fù)核提供復(fù)核的材料為具松材線蟲(chóng)雌雄成蟲(chóng)的線蟲(chóng)分離液9監(jiān)測(cè)樣品的保存及處理），A.1發(fā)現(xiàn)歷史和背景松材線蟲(chóng)最早于1929年從美國(guó)德克薩斯州的長(zhǎng)葉松（Pinuspalustris）木材中分離到，被描述為等確認(rèn)其為異名，松材線蟲(chóng)從此被定名為Bursaphe1970。A.2地理分布美國(guó)、加拿大、墨西哥、日本、韓國(guó)、西班牙、葡萄A.3侵染循環(huán)松材線蟲(chóng)通過(guò)墨天牛屬（Monochamus）昆蟲(chóng)在寄主植物間傳播。天牛蛹中羽化后即將離開(kāi)寄主樹(shù)通過(guò)傷口進(jìn)入松樹(shù)后，立即轉(zhuǎn)為繁殖階段，4d～5d即可發(fā)育為成蟲(chóng)。松材線蟲(chóng)利用天牛的發(fā)育過(guò)程，通過(guò)取食和產(chǎn)卵這兩種途徑，傳播到新的寄A.4傳播途徑），納墨天牛（M.carolinensis），葡萄牙為樟子松墨天牛（M.galloprovincialis）。天牛科其它屬樹(shù)加工成的木質(zhì)包裝材料中經(jīng)常被截獲。因此，松材線蟲(chóng)A.5松材線蟲(chóng)生活史段。在25℃的有利條件下，松材線蟲(chóng)從卵開(kāi)始，經(jīng)過(guò)4個(gè)繁殖階段的幼蟲(chóng)齡期（J1至J4在4蟲(chóng)在腸道細(xì)胞中積累脂肪，可在干旱、低溫或營(yíng)養(yǎng)缺乏的逆境下存活。通常該齡幼蟲(chóng)蛻皮成為分散型4齡幼蟲(chóng)JIV（持久型幼蟲(chóng)），再由媒介甲蟲(chóng)傳播給新的樹(shù)木。然而，如果條件變得適合線蟲(chóng)發(fā)育，例如將分散型3齡幼蟲(chóng)JⅢ接種到真菌培養(yǎng)皿中，線蟲(chóng)會(huì)發(fā)育成為繁殖型4齡幼蟲(chóng)J松材線蟲(chóng)的寄主主要是松屬（Pinusspp.）針葉木，我國(guó)寄主主要加拿大云杉（P.canadensis）、北美云杉（P.pungens）、歐洲落葉松（Larixeuropaea）、美加落葉松松屬以外的寄主很少在感染松材線蟲(chóng)后死亡。目前僅美國(guó)報(bào)道藍(lán)杉（Piceapungens）和花旗松（Pseudotsugamenziesii）感染松材線A.7松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)尾形變化綜述的占77%（其中圓尾型占44%超過(guò)1μm（1.46μm～3.41μm）的占23%。2005年，尖突，平均長(zhǎng)度約為1.7μm，最長(zhǎng)達(dá)2.9μm。但該線蟲(chóng)經(jīng)μm～1μm。但經(jīng)過(guò)灰葡萄孢人工培養(yǎng)一月后，超過(guò)一半雌蟲(chóng)有1μm～2μm的尾尖突，另有大約10%的雌蟲(chóng)尾尖突為2μm～2.4μm，其余雌蟲(chóng)則無(wú)尾尖突或小于0.5μm。2020年，顧建鋒等從遼寧紅松分離到一種具明顯尾尖突的松材線蟲(chóng)，其雌蟲(chóng)尾末松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)均有尾尖突、或者尾尖突長(zhǎng)度超過(guò)2μm的情況是比較號(hào)——偽傘滑刃線蟲(chóng)B.fraudulentusRühm，1956（J.B.Goodey，1960）——擬松材線蟲(chóng)B.mucronatu——灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)B.luxurio——楊傘滑刃線蟲(chóng)B.populiTomalak&Filipiak，2010——擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)B.paraluxuriosaeGu,Wang,Braasch,2012——日本冷杉傘滑刃線蟲(chóng)B.firmaeKanzaki,Maehara,Aikawa&Matsumato,2012——韓國(guó)傘滑刃線蟲(chóng)B.koreanusGu,Wang&Chen,2013——吉拉尼傘滑刃線蟲(chóng)B.gillaniiSch?nfeld,Braasch,Riedel&Gu,2013——錦天牛屬傘滑刃線蟲(chóng)B.acaloleptaeKanzaki,Ekino,Maehara,Aikawa&Giblin-Davis,203%，其余絕大部分均有或長(zhǎng)或短的尾尖突，末端鈍圓或銳圖D.4遼寧紅松中分離到的松材線蟲(chóng)些群體大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培養(yǎng)后消失。目前M型松材線蟲(chóng)僅分布于北美，其寄主主要是ABDEFHJILABDEFHJILCCGGKK加熱10min，即得到線蟲(chóng)DNA模板。得到的DNA提取液可直X-FX-R222ddH2O以松材線蟲(chóng)DNA模板作為陽(yáng)性對(duì)照，以不含松材線蟲(chóng)的DNA模板作為陰性對(duì)照，以ddH2O作為空V/cm～5V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度電泳，約0.5h，將瓊脂糖凝膠置于凝膠采用X-F/X-R引物對(duì)擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)得到與陽(yáng)性對(duì)照一致的560bp左右大小的特有條帶2212ddH2O熒光信號(hào)的收集條件應(yīng)與探針的熒光基團(tuán)一致，具體設(shè)置方法參照相應(yīng)熒光P應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct10×PCRBuffer（Mg2+free)、蛋白酶K、2×TaqMasterMix預(yù)混該引物正常的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為800bp左右，若樣品PCR擴(kuò)增獲得正使用Chormas軟件或其他序列分析軟件，對(duì)28S基因測(cè)序得到的雙向峰圖文件（后綴名.ab）進(jìn)行拼接。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，去除測(cè)序結(jié)果兩端峰形雜亂的低質(zhì)量ttps:///Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)。在BasicBLAST中選擇nucleotideblast，在r若待測(cè)樣品序列與已知的松材線蟲(chóng)序列（AY508107.1、EF446929.1-EF446933.1、EF446935.1、AM396580.1等）相似性（Per.Ident值）達(dá)98.98%以上，與其他種類的相似性材線蟲(chóng)陽(yáng)性。若待測(cè)樣品序列與已知的松材線蟲(chóng)相似性低于98.98%如BLAST結(jié)果所顯示的線蟲(chóng)不是傘滑刃屬線蟲(chóng)，甚至不是線蟲(chóng)，很可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于操作不[1]顧建鋒,王江嶺.傘滑刃屬線蟲(chóng)形態(tài)和分子鑒定圖譜[M].廈門(mén)大學(xué)出版社,2011.[2]劉偉,楊寶君.松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)雄蟲(chóng)交合傘形狀的比較[J].林業(yè)科學(xué)研究,1995,10(2):223-225.[3]夏永剛,王明旭,張玉榮,等.臨湘市具尾尖突松材線蟲(chóng)病病原的鑒定及病源分析[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(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