免疫組化技術(shù)

關(guān)于免疫組化技術(shù)課件第1頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月組織化學(xué)的基本概念：

組織化學(xué)：組織水平，對(duì)組織內(nèi)存在的各種物質(zhì)進(jìn)行定性、定量以及其局部的和移動(dòng)的部位分析的方法

免疫組織化學(xué)：基于抗原抗體反應(yīng)酶組織化學(xué)第2頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月疾病的病理學(xué)研究概括起來(lái)主要在基因和蛋白水平上進(jìn)行的研究。

免疫組織化學(xué)方法主要用于基因蛋白質(zhì)水平表達(dá)的研究。蛋白表達(dá)=>分布，定位，定量；蛋白表達(dá)與與腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后關(guān)系等第3頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月材料：抗體：多克隆抗體：為針對(duì)多個(gè)抗原決定簇的抗體，為產(chǎn)生抗體的動(dòng)物血清或免疫球蛋白。單克隆抗體：為一個(gè)B淋巴細(xì)胞分化增殖產(chǎn)生的抗體，可識(shí)別有限的抗原決定簇，特異性強(qiáng)。第4頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月顯示物：酶標(biāo)反應(yīng)：①堿性磷酸酶（Alkatinephasphotase,AP）AP與不同的底物（萘酚As-Mx、快藍(lán)、快紅）作用，可形成不同顏色的終產(chǎn)物。用新品紅（Newfuchsine）顯色，可形成不溶于有機(jī)溶劑的紅色沉淀，不褪色。②辣根過(guò)氧化酶(Horseradiseperoaidase,)HRP：底物為DAB－四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺，產(chǎn)生棕色沉淀，不溶于有機(jī)溶劑，不褪色。第5頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HRP第6頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月APHE第7頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月熒光標(biāo)記：熒光素標(biāo)記抗體異硫氰酸熒光素（Fluorescienisothioyarale,FITC）520－530nm四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（Teramethylerhodamineisothiecyanata,TRITC）620nm四乙基羅達(dá)明（TeraethylerhodamineB200,RB200）590－600nm第8頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第9頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月膠體金：指金的水溶膠（以微小粒子分散在水溶液中，免疫電鏡觀察第10頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要方法：直接法：間接法：經(jīng)過(guò)了第二抗體放大效應(yīng)PAP法：以過(guò)氧化物酶和抗過(guò)氧化酶抗體形成復(fù)合物，通過(guò)第二抗體的橋接與第一抗體結(jié)合，然后以酶底物反應(yīng)檢出。

第11頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第12頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ABC法：生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）為具有高度親合性的物質(zhì)，一個(gè)卵白素分子可結(jié)合4個(gè)生物素。當(dāng)生物素標(biāo)上特定的標(biāo)記物質(zhì)后or與抗體結(jié)合后仍能與卵白素結(jié)合，因此，將抗體結(jié)合上生物素，然后與卵白素和帶有特殊標(biāo)記物的生物素的結(jié)合反應(yīng)，而以適當(dāng)方式顯示。第13頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月S-P法（LSAB）：采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉素生物素蛋白連接的過(guò)氧化物酶及基質(zhì)素（底物）混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原。第14頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EnvisionⅠ法（二步法）：原理：第二抗體上標(biāo)記有多聚物酶（HRPorAP）復(fù)合物與第一抗體結(jié)合。二抗上的多聚物可結(jié)合許多的HRP分子，使信號(hào)有顯著提高，敏感性較PAP法，ABC法高出幾十倍，背景因多聚物葡聚糖是人體內(nèi)不存在，無(wú)非特異性干擾，尤其是多聚物酶分子結(jié)合的第二抗體孵育時(shí)間短，該方法更省時(shí)，簡(jiǎn)便。第15頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以LSAB法為例簡(jiǎn)單介紹染色步驟：①石蠟切片脫蠟－水；②3%H202抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15min；③每張切片加10-20ul非免疫性動(dòng)物血清，室溫孵育5min；④加特異性一抗，370C孵育30－60min，or40C過(guò)夜；⑤加20ul生物素標(biāo)記的第二抗體，370C

，30min；第16頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月⑥加過(guò)氧化物酶標(biāo)定的鏈菌素親生物素，370C，30min；⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min；⑧用過(guò)氧化物酶基質(zhì)液（DAB基質(zhì)液）顯色5－15min。在光鏡下觀察。⑨自來(lái)水沖洗，蘇木素淺染，自來(lái)水沖洗還藍(lán)，梯度酒精脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。第17頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月免疫組化常見(jiàn)問(wèn)題的處理：組織材料的處理：固定液為：10%中性福爾馬林液；4%多聚甲醛磷酸緩沖液（PH7.4）；固定時(shí)間：8-24hr組織大小：2*1.5*0.3cm第18頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月防脫片處理：多聚-L-賴(lài)氨酸；硫酸鉻鉀明膠液。第19頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月增強(qiáng)特異性染色的措施和方法：

1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化（0.05-0.1%）；b、胃蛋白酶消化（0.4%）。2）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)：方法：微波960C,10min；直接加溫方法1000C,10min；高壓鍋1200C,10min；熱處理液：0.01mol/LPH6.0檸檬酸緩沖液第20頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月合適的抗體稀釋度：

過(guò)高，過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致陰性結(jié)果。即用型抗體；濃縮型。第21頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月減少或消除非特異性染色的方法：非特異性染色：原因：方法：第22頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第23頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)照：

陽(yáng)性對(duì)照：用一直抗原陽(yáng)性的切片與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)呈陽(yáng)性結(jié)果，即為陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照：用不含一直抗原的標(biāo)本作對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，即為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照中還包括空白對(duì)照、替代對(duì)照、吸收和抑制對(duì)照等，用以排除假陽(yáng)性結(jié)果。第24頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)均勻染色或更強(qiáng)顯色定位特定，具有結(jié)構(gòu)性無(wú)特定部位，無(wú)結(jié)構(gòu)性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無(wú)分布規(guī)律，某一片均勻著色

免疫組織化學(xué)的結(jié)果判斷應(yīng)非常嚴(yán)謹(jǐn)，陽(yáng)性細(xì)胞的染色分布有三種類(lèi)型：胞漿型、細(xì)胞核型和細(xì)胞膜表面型。陽(yáng)性細(xì)胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的依據(jù)。陽(yáng)性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并于陰性細(xì)胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，兩者可顯著區(qū)別。第25頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月陽(yáng)性細(xì)胞的染色特征：

①陽(yáng)性細(xì)胞的染色分布有三種：

胞漿；細(xì)胞核；細(xì)胞膜表面②陽(yáng)性細(xì)胞分布：灶性；彌漫性③染色強(qiáng)度不一④切片邊緣，刀痕or組織折疊，壞死，擠壓區(qū)，膠原結(jié)締組織等常表現(xiàn)為相同的陽(yáng)性染色強(qiáng)度。對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的定量判斷：-，+，++，+++等分級(jí)和計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)

第26頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月垂體腺瘤ACTH第27頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺癌c-erbB-2第28頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月免疫組化A細(xì)胞B細(xì)胞D細(xì)胞第29頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月上皮性腫瘤標(biāo)記上皮膜抗原（EMA）：

廣泛分布于各種正常上皮細(xì)胞膜及腫瘤中。癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎兒消化道上皮，胰腺以及絕大部分內(nèi)臟癌。

前列腺特異性抗原（PSA）：甲胎蛋白（AFP）：甲狀腺球蛋白（Tg）：第30頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月軟組織標(biāo)記軟組織：全身各處的纖維結(jié)締組織，脂肪組織，肌肉組織，滑膜組織及血管淋巴組織。肌動(dòng)蛋白（Actin）：分布于所有的肌型細(xì)胞中肌紅蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌漿中的一種可溶性蛋白，具有較高組織特異性。第31頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD34：主要標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞；亦可用于各種腫瘤間質(zhì)中血管生成的研究。第八因子相關(guān)抗原（Factor-Ⅷ-relatedantigen,FⅧ-RAg）：血管瘤陽(yáng)性表達(dá)程度強(qiáng)于血管肉瘤。CD34優(yōu)于FⅧ-RAg。溶菌酶（Lysozyme）：為組織細(xì)胞及其腫瘤的標(biāo)記物?？挂让拥鞍酌福ˋAcT）：主要用于惡纖組的診斷。

第32頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月淋巴細(xì)胞標(biāo)記物：白細(xì)胞共同抗原（LCA,CD45）：主要分布于T,B細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞表面。CD20：B細(xì)胞標(biāo)記物。CD45RO、CD3：T細(xì)胞標(biāo)記物。CD57：為自然殺傷細(xì)胞的標(biāo)記物。CD38：為漿細(xì)胞的標(biāo)記物。CD68：主要標(biāo)記各種組織中的巨噬細(xì)胞。第33頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物：嗜鉻素A（Chromogranin,CgA）：存在于神經(jīng)元，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及其腫瘤中。突觸素（Synaptophysin,Sy）：存在于神經(jīng)元突觸前囊泡膜上，腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中。髓磷脂鹼性蛋白（Myelinbasicprotein,MBP）：

第34頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月激素及激素受體類(lèi)標(biāo)記：雄激素受體（Androgenreceptor,AR）：雌激素受體（Estrogenreceptor,ER）孕激素受體（Progesteronereceptor,PR）：垂體激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH主要用于垂體腺瘤的功能分類(lèi)。降鈣素（Calcitotin,CT）：甲狀腺旁細(xì)胞（C細(xì)胞）分泌。

第35頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以上抗體及標(biāo)記物主要用于疾病的病理診斷和鑒別診斷其聯(lián)合應(yīng)用的作用和意義：Keratin＋Vimentin－上皮性腫瘤Keratin＋滑膜腫瘤Vimentin＋間皮腫瘤上皮樣肉瘤癌肉瘤第36頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Des＋orActin＋肌源性腫瘤CD34＋orFⅧ＋血管性腫瘤Keratin－S-100＋orMBP＋神經(jīng)鞘膜瘤Vimentin＋LCA＋淋巴細(xì)胞

AACT＋骨腫瘤、纖維組織細(xì)胞腫瘤GFAP＋膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤

Keratin－NSE＋orSy＋Vimentin－NF－／＋節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤第37頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月免疫組化用于病理診斷及鑒別診斷原則：①免疫組化用于病