免疫細胞的分離技術(shù)

關(guān)于免疫細胞的分離技術(shù)第1頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

免疫系統(tǒng)的組成免疫系統(tǒng)免疫器官中樞:胸腺、骨髓周圍：淋巴結(jié)、脾臟、粘膜

相關(guān)淋巴組織等免疫細胞：淋巴細胞、單核-巨噬細胞、

粒細胞、DC、肥大細胞、

NK細胞免疫分子：抗體、補體、細胞因子、MHC、

TCR、粘附分子等第2頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

Innateimmunity

固有免疫

定義：人類在種系進化過程中形成的、經(jīng)遺傳獲得

的免疫，遇病原體后首先并迅速起防衛(wèi)作 用的免疫應(yīng)答組成：皮膚、粘膜及其產(chǎn)物、細胞（NK細胞、單

核-吞噬細胞、DC、NKT、中性粒細胞、T

細胞、B1細胞）等特點：先天具有、無潛伏期、無特異性、無記憶性作用時間：0-96小時第3頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

Adaptiveimmunity

獲得性(適應(yīng)性)免疫

定義：機體在生活過程中，因接觸抗原性物質(zhì)而獲

得的免疫。T、B細胞識別病原體成分后產(chǎn) 生的免疫應(yīng)答特點：后天獲得、有潛伏期、特異性，記憶性參與細胞：T細胞和

B細胞起作用時間：晚，一般在感染后4-5天發(fā)揮作用第4頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月一、免疫細胞的種類與特征第5頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

免疫細胞的分類根據(jù)免疫細胞在免疫應(yīng)答中的作用可分為三類免疫活性細胞(immunocompetentcells)抗原提呈細胞(antigen-presentingcells,APC)其他細胞凡參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細胞，通稱為免疫細胞（immunocyte），其中包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞DC、肥大細胞、粒細胞等第6頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

免疫細胞的起源與分化第8頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫活性細胞具有特異性抗原受體、在接受抗原刺激下發(fā)生克隆性活化、增值和分化，產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答（adaptiveimmuneresponse)的細胞。這類細胞是機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，包括T細胞、B細胞第9頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原提呈細胞

（antigenpresentingcell,APC）加工處理抗原，將抗原肽提呈給抗原特異性淋巴細胞的一組免疫細胞。血液中主要的APC細胞主要包括單核細胞、樹突狀細胞、B細胞第10頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月其他細胞自然殺傷(NK)細胞，肥大細胞，嗜酸性粒細胞，嗜中性粒細胞，嗜堿性粒細胞，血小板等NK細胞肥大細胞嗜酸性粒細胞嗜中性粒細胞嗜堿性粒細胞血小板第11頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫細胞的特征1、免疫細胞的形態(tài)學特征理化性狀生物學特性第12頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫細胞的特征2、免疫細胞的表面分子特征：白細胞分化抗原指血細胞分化成熟為不同譜系、分化的不同階段以及細胞活化過程中,出現(xiàn)或消失的細胞表面標記分子聚類分化群(分化抗原，clusterofdifferentiation，CD)：應(yīng)用單克隆抗體鑒定為主的方法，將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原稱為CD抗原CD抗原常用于鑒定和檢測淋巴細胞表面標志第13頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月人CD分組分組

CD（舉例）T細胞

CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、

CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)B細胞

CD19、CD20、CD21、CD40、CD79a(Ig)、CD79b(Ig)、

CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、

CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)髓樣細胞

CD14、CD35(CR1)、CD64(FcRI)、CD256(APRIL)、

CD257(BAFF)、CD312(EMR2)

血小板

CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v)、

CD61(整合蛋白3)、CD62P(P選凝素)NK細胞

CD16(FcRIII)、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、

CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、

CD336(NKp44)、CD337(NKp30)

非譜系

CD30、CD32(FcRII)、CD45RA、CD45RO、CD46(MCP)、

CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、CD279(PD1)、

CD281CD284(TLR1-TLR4)、CD289(TLR9)、CD305(LAIR-1)、

CD306(LAIR-2)、CD319(CRACC)第14頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月人CD分組分組

CD（舉例）黏附分子

CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18(整合蛋白2)、

CD29(整合蛋白1)、CD49aCD49f、CD54(ICAM-1)、

CD62E(E整合蛋白)、CD62L(L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、

CD325(N-cadherin)、CD326(EpCAM)細胞因子/CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw137、CD178(FasL)、趨化因子受體

CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、

CD261CD264(TRAIL-R1TRAIL-R4)內(nèi)皮細胞

CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、

CD144(VE鈣黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、

CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322)碳水化合物結(jié)構(gòu)

CD15u、CD60aCD60c、CD75、CDw327CDw329(siglec6、7、9)樹突狀細胞

CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、CD274CD276(B7H1-B7H3)、

CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)干細胞/祖細胞

CD133、CD243

基質(zhì)細胞

CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、

CD331CD334(FGFR1FGFR4)、CD339(Jagged-1)紅細胞

CD233CD242

第15頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫細胞的分離技術(shù)

（一）

外周血單個核細胞分離（二）

T淋巴細胞及其亞群的分離（三）

B淋巴細胞及其亞群的分離（四）

Mo/M?分離技術(shù)

（五）NK細胞的分離技術(shù)

第16頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫細胞分離基本原理不同細胞密度不同不同細胞表面生物學特性不同不同細胞表面分化抗原不同第17頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)不同的實驗?zāi)康目梢圆扇∠铝胁煌姆蛛x方法免疫細胞的分離技術(shù)1、密度梯度離心法2、黏附分離法（尼龍毛法、貼壁法、親和板法）3、磁性分離法4、熒光激活分離法5、其他分離法（花環(huán)沉降法）第18頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）外周血單個核細胞分離

外周血單個核細胞（peripheralblood

mononuclearcells,PBMC）包括淋巴細胞和單核細

胞Ficoll分離液法主要用于分離外周血中的單個核細

胞，是根據(jù)不同細胞密度不同的分離法第19頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月不同細胞密度不同

單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）的密度

為1.077左右人的紅細胞密度為1.093，>1.077

粒細胞密度為1.092，>1.077

血小板密度

<1.077

第20頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月肝素抗凝靜脈血與等量Hank’s液或PBS混勻沿管壁緩慢疊加于Ficoll分層液面上水平離心2000rpm×20min

離心后管內(nèi)分三層，用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞洗滌細胞兩次RPMI1640重懸細胞臺盼蘭染液混合計數(shù)細胞活力檢測：死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色活細胞數(shù)

活細胞百分率＝──────×100％

總細胞數(shù)

方法用本法分離PBMC，一般純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上第21頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）T淋巴細胞及其亞群的分離第22頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月T淋巴細胞亞群T細胞的發(fā)育階段分類表達TCR的類型分類是否表達CD4或CD8T細胞功能分類第23頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月T淋巴細胞亞群T細胞的發(fā)育階段分類初始T細胞naiveTcells

未經(jīng)抗原刺激的成熟T細胞，表達CD45RA效應(yīng)T細胞

effectorTcells

表達高親和力IL-2R，介導免疫效應(yīng)記憶T細胞memoryTcells

表達CD45RO，介導再次免疫應(yīng)答第24頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月T淋巴細胞亞群表達TCR的類型分類

TCRαβ+T細胞

TCRγδ+T細胞

第25頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月T淋巴細胞亞群是否表達CD4或CD8

CD4+T細胞

CD8+T細胞

第26頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月T淋巴細胞亞群T細胞功能分類

輔助性T細胞HelperTcells,Th

效應(yīng)T細胞EffectorTcells,TE細胞毒T細胞CytotoxicTlymphocytes,CTL遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)T細胞DelayedTcells，Td初始T細胞NaiveTcells

調(diào)節(jié)性T細胞RegulatoryTcells，Tr記憶T細胞MemoryTcells，Tm抑制性T細胞SuppressorTcells，Ts

第27頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月輔助性T細胞HelperTcells,Th

Th1:細胞免疫

Th2：體液免疫Th17：炎癥反應(yīng)第28頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月輔助性T細胞HelperTcells,ThTGF-+IL-6第29頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月輔助性T細胞HelperTcells,Th濾泡輔助性T細胞（T

follicular

helper，Tfh）通過細胞因子IL-10和IL-21來調(diào)節(jié)B細胞的功能

第30頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的分化Foxp+T調(diào)節(jié)細胞可以從胸腺直接分化，也可在TGF-作用下從Foxp3-T細胞分化。調(diào)節(jié)性T細胞RegulatoryTcells，Tr第31頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月玫瑰花結(jié)法（E花環(huán)沉降法）尼龍毛柱分離法淘洗法免疫磁珠法流式細胞術(shù)分選法（二）T淋巴細胞及其亞群的分離第32頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月人T淋巴細胞表面表達CD2分子，即綿羊紅細胞受體，B細胞則無。在適當?shù)臈l件下，可與綿羊紅細胞（SRBC）結(jié)合，形成玫瑰花結(jié)（rosette）,因為紅細胞環(huán)繞T細胞，形似花環(huán)，所以又稱E-花環(huán)（E-rosette）該實驗常用于臨床檢測人外周血T淋巴細胞的數(shù)量和比例，由此可間接反映機體的細胞免疫功能狀況

玫瑰花結(jié)法第33頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月淋巴細胞+SRBC懸液→37°C水浴10min→低溫低速離心→T細胞形成E花環(huán)而沉于管底→懸液中為B細胞。方法

第34頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細胞、漿細胞、單核細胞和一些輔助細胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而T細胞不與尼龍毛粘附的特性，這是獲得富含T細胞群的有效方法尼龍毛柱分離法第35頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月簡單，快速，經(jīng)濟，尼龍毛可反復(fù)利用可分離大量細胞細胞不會被激活，可用于功能測定純度不高耗時優(yōu)點

缺點

第36頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月也叫親合板結(jié)合分離法(immunepanningisolation）。利用親合層析和抗體固相包被原理，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，由于各種淋巴細胞亞群具有不同抗原性的特點和表面標志，加細胞懸液后，凡抗原陽性的細胞則與相應(yīng)的固相抗體結(jié)合，抗原陰性的細胞可從未吸附的細胞懸液中獲取同理若用特異性抗原交聯(lián)于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細胞。但淋巴細胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細胞激活，因此，凡欲去除細胞懸液內(nèi)某一細胞亞群時，本法更合適

淘洗法第37頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月親和板分離淋巴細胞示意圖第38頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月利用T淋巴細胞表面某種標志性抗原與包被在固相載體上的特異性單抗結(jié)合，將T細胞與其他細胞分離的方法T淋巴細胞淘洗分離原理第39頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月羊抗兔Ig包被平皿

CD4一抗培育T細胞，倒入平皿，4℃孵育1小時；

收集未粘附的CD4-T細胞

PBS漂洗非特異吸附的CD4-T細胞

收集粘附的CD4+T細胞，可以用刮板刮取并在顯微鏡下觀察方法

（以CD4+T細胞為例）第40頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離

免疫磁珠法

（Magneticactivatedcellsorting,MACS）第41頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月NS陽性選擇法（正選）

第43頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月NS陰性選擇法（負選）

第44頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月第45頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫磁珠細胞分選裝置第46頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月將特異性抗T細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合T細胞在磁場中，結(jié)合T細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫T細胞免疫磁珠法陽性選擇T細胞

第48頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月將多種特異性抗非T細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非T細胞在磁場中，結(jié)合其它細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的T細胞被洗脫下來免疫磁珠法陰性選擇T細胞

第49頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月CD4+TCellIsolationKitIINon-CD4+TcellsinPBMC,i.e.,CD8+Tcells,γ/δTcells,Bcells,NKcells,dendriticcells,monocytes,granulocytes,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledbyusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesagainstCD8,TCRγ/δ,CD19,CD56,CD14,CD16,CD36,CD123,andCD235a(glycophorinA).ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletion.Thereby,highlypureCD4+Tcellsareobtained.免疫磁珠法陰性選擇CD4+T細胞實例

PBMCbeforeseparationUntouchedCD4+Tcells第50頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光激活細胞分離法

(fluorescenceactivatedcellsorter,FACS)第51頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月FACS用途：用流式細胞儀對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%第52頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月方法

（以CD4+T細胞為例）PBMC用PBS洗滌，低溫離心棄上清；加入含AB血清的PBS封閉，4℃孵育10分鐘；加入適量的PerCP-CD3，APC-CD4抗體，4℃孵育30分鐘；PBS洗滌，低溫離心棄上清并用RPMI1640重懸；流式細胞術(shù)分選；第54頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）B淋巴細胞及其亞群的分離如果僅考慮PBMC中T細胞和B細胞，那么所有從PBMC中分離T淋巴細胞的方法實際上也可用于分離B淋巴細胞。第55頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月B細胞表面標志

SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細胞的重要表面標志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標CD19/CD5分子：可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞

第56頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月終濃度5mML-leucinemethylester(L-LME)重懸PMBC，混勻，室溫35s離心，400g，10min，棄上清，PBS洗滌細胞重懸于25mlRPMI1640培養(yǎng)基，過尼龍毛柱，去除細胞團塊玫瑰花結(jié)法去除T細胞抗CD19或CD20單抗標記，流式細胞儀檢驗B細胞純度去除Mo/M?法

第57頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月將特異性抗B細胞表面分子CD19的單克隆抗體免疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合B細胞在磁場中，結(jié)合B細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫CD19+B細胞

免疫磁珠法陽性選擇B細胞

第58頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月將多種特異性抗非B細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非B細胞在磁場中，結(jié)合其它細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的B細胞被洗脫下來免疫磁珠法陰性選擇B細胞

第59頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月BCellIsolationKitIINon-Bcells,i.e.,Tcells,NKcells,monocytes,dendriticcells,granulocytes,platelets,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledusingacocktailofbiotinylatedCD2,CD16,CD14,CD36,CD43,andCD235a(glycophorinA)antibodies.ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletion.HighlypureBcellsareobtainedbydepletionofmagneticallylabelednon-Bcells.PBMCbeforeseparationUntouchedBcells免疫磁珠法陰性選擇B細胞實例

第60頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）Mo/M?分離技術(shù)單核-巨噬細胞包括骨髓中的前單核細胞、外周血中的單核細胞、以及組織內(nèi)的巨噬細胞(Mφ)。Mφ來源于血液中的單核細胞，而單核細胞又來源于骨髓中的前體細胞。第61頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月Mo/M?細胞表面標志

表面標志抗原：CD14，但CD14也表達在粒細胞。CD14主要強表達在單核-巨噬細胞，弱表達在粒細胞上第62頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

無血清RPMI1640培養(yǎng)液將PBMC2×106cell/ml重懸；75ml培養(yǎng)瓶中加入10

ml細胞懸液，于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育1小時；吸盡培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)液漂洗2遍，去除非黏附細胞；細胞刮片輕輕刮取黏附的單核細胞。黏附法第63頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月快速，方便純度和得率均較低易引起Mo/M?激活，引起基因表達和分泌蛋白優(yōu)點

缺點

第64頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月將特異性抗單核細胞表面分子CD14的單克隆抗體免疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合單核細胞在磁場中，結(jié)合單核細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫CD14+單核細胞免疫磁珠法陽性選擇單核細胞

第65頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月將多種特異性抗非單核細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非單核細胞在磁場中，結(jié)合其它細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的單核細胞被洗脫下來免疫磁珠法陰性選擇單核細胞

第66頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

MonocyteIsolationKitIINon-monocytes,suchasTcells,NKcells,Bcells,dendriticcells,andbasophils,areindirectlymagneticallylabeledusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesagainstCD3,CD7,CD56,CD19,CD16,CD123,andCD235a(GlycophorinA),aswellasAnti-BiotinMicroBeads.Highlypureunlabeledmonocytesareobtainedbydepletionofthemagneticallylabeledcells.PBMCbefo