體外受精胚胎移植技術(shù)

關(guān)于體外受精胚胎移植技術(shù)第1頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.體外受精1.1定義：體外受精(InVitroFertilization)是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)，英文簡稱為IVF。第2頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月Invitro

fertilization

or

fertilisation

(IVF)isaprocessbywhich

anegg

isfertilised

by

sperm

outsidethebody:

invitro

("inglass").Theprocessinvolvesmonitoringandstimulatingawoman'sovulatoryprocess,removing

anovumorova

(eggoreggs)fromthewoman's

ovaries

andlettingspermfertilisetheminaliquidinalaboratory.Thefertilisedegg(zygote)isculturedfor2–6daysinagrowthmediumandisthen

implanted

inthesameoranotherwoman's

uterus,withtheintentionofestablishingasuccessful

pregnancy.第3頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.2體外受精的發(fā)展歷史1878年，德國科學(xué)家Schenk就開始進行哺乳動物卵子體外受精的嘗試。1945年，美籍華人張明覺成功的進行了兔體外受精，但在此后的5年里沒有能再重復(fù)出這一結(jié)果。這個時期的體外受精工作主要建立在經(jīng)驗基礎(chǔ)上。1951年，張明覺和澳大利亞的Austin幾乎同時發(fā)現(xiàn)只有在雌性生殖道內(nèi)停留一段時間的精子才能成功的與卵結(jié)合，進行體外受精。精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)是體外受精史上的一個里程碑。1959年，張明覺利用體內(nèi)獲能處理的精子進行體外受精實驗，獲得世界上首例“試管動物”—試管兔，為哺乳動物體外受精工程奠定了基礎(chǔ)。從此結(jié)束了生殖生物學(xué)界幾十年來對哺乳類卵子體外受精能否成功的爭論。第4頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月20世紀(jì)60年代以后，體外受精研究迅速發(fā)展，在家兔、小鼠、大鼠、人、牛、豬、狒狒、獼猴、綿羊、山羊和老虎等10多種動物獲得了試管后代。1978年7月25日，第一例試管嬰兒LouiseBrown在英國誕生，這是體外受精技術(shù)走向全面應(yīng)用的標(biāo)志性事件，是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上的一次偉大的革命。1988年，中國大陸首例試管嬰兒鄭萌珠誕生。由北京醫(yī)科大學(xué)的張麗珠等人完成。第5頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月“試管嬰兒之父”、英國科學(xué)家羅伯特-愛德華茲，2010年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。(帕特里克·斯特普托)

第6頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.3體外受精的發(fā)展階段第一代：1978年英國專家steptoe和Edowrds定制了世界上第一個試管嬰兒，被稱為人類醫(yī)學(xué)史上的奇跡。它是將精子和卵子置于體外利用各種技術(shù)使卵子受精，培養(yǎng)幾天后移入子宮，使女性受孕生子。第二代：1992年由比利時Palermo醫(yī)師首次在人體成功應(yīng)用卵漿內(nèi)單精子注射（ICSI），使試管嬰兒技術(shù)的成功率得到很大的提高。第三代：隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來，在人工助孕與顯微操作的基礎(chǔ)上，胚胎著床前遺傳病診斷（PGD）開始發(fā)展并用于臨床，使不孕不育夫婦不僅能喜得貴子，而且能優(yōu)生優(yōu)育。第8頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月ICSI,intracytop-lasmicsperminjection,assistedhatching第9頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月Preimplantationgeneticdiagnosis(PGD)PolarbodyPGDBlastomerePGD第10頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.4體外受精過程第11頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.4.1卵母細胞的采集卵母細胞的采集方法通常有三種：(1)超數(shù)排卵。(2)從活體卵巢中采集卵母細胞。(3)從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細胞。第12頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（1)控制性超數(shù)排卵由于自然月經(jīng)周期的長短因人而異，同一患者不同周期也存在差異，所以不易安排取卵時間，而且自然周期中只有一個優(yōu)勢卵泡發(fā)育，受精后只能形成一個胚胎，而移植一個胚胎的妊娠率是很低的。所以需要采用控制性超排卵來增強與改善卵巢功能，以達到不受自然周期的限制、獲得多個健康卵子的目的，提供多個胚胎移植，并盡可能使黃體發(fā)育與子宮內(nèi)膜功能同步。控制性超排卵一般是先用GnRHa使體內(nèi)FSH和LH降調(diào)，再施與HMG或FSH排卵藥物，刺激卵巢中的卵泡成長，依據(jù)患者對藥物的反應(yīng)性調(diào)整藥物使用劑量，患者的年齡及藥物的使用劑量不同，所獲得的卵子數(shù)亦不同。

第13頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月(2）從活體卵巢中采集卵母細胞卵巢卵母細胞的活體采集主要用于非屠宰大中型動物重復(fù)進行卵母細胞的采集?？刹捎檬中g(shù)法也可以在超聲波圖像或腹腔鏡引導(dǎo)下進行卵巢卵母細胞活體采集。第14頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月Ⅰ.卵巢卵母細胞的活體采集手術(shù)活體采集暴露動物卵巢，用含有采卵液的注射器抽吸卵泡的卵泡液。超聲波圖像引導(dǎo)下的卵巢卵母細胞活體采集優(yōu)點：穿刺孔小。缺點：不如腹腔鏡直觀，且回收率低腹腔鏡引導(dǎo)下的卵巢卵母細胞活體采集非手術(shù)法，對母體無傷害。第15頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細胞離體卵巢卵母細胞的采集一般用于從屠宰的大中型動物卵巢上采集卵母細胞或收集腔前卵泡卵母細胞。采卵前準(zhǔn)備卵巢保存液、采卵液、采集卵巢器械及采卵器械。第16頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月Ⅰ.離體卵巢卵母細胞的采集屠宰家畜，30分鐘內(nèi)取出卵巢；0.9%溫生理鹽水沖洗；11h內(nèi)送回實驗室采卵。25℃,超凈工作臺內(nèi)，去除韌帶和輸卵管，沖洗血污；有腔卵泡采用抽吸法、切割法或剝離法收集卵母細胞。特點：快速、無菌第17頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月抽吸法注射器吸取采卵液，輕刺入卵泡中，吸取卵母細胞。切割法切割卵巢，回收液體，實體顯微鏡下?lián)斐雎涯讣毎?。剝離法剝?nèi)⊥暾膱A形卵泡，切開卵泡，收集卵母細胞。麻煩，損傷小腔前卵泡-無腔卵泡的收集剪碎卵巢，膠原酶消化(或組織切碎機)，過網(wǎng)篩，收集卵母細胞。第18頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月抽吸法用裝有5號針頭的5mL注射器吸取2mL采卵液，將針頭輕輕刺入人2~5mm(羊)或2~8mm(牛)的卵泡中連同卵泡液吸取卵母細胞，每吸2~5個卵泡后，將注射器內(nèi)的液體緩慢注入檢卵杯中，以備檢查。第19頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）卵母細胞形態(tài)分類依據(jù)卵丘細胞-卵母細胞復(fù)合體(COC)的外形。只有A和B級卵母細胞可用于成熟培養(yǎng)。A級：3層以上完整而致密的卵丘細胞B級：卵丘細胞3層以下，部分脫落。C級：卵丘細胞擴展而松散。D級：卵丘細胞全部脫落，裸卵。第20頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.4.2卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體外受精獲取成熟卵母細胞主要通過以下兩條途徑：（1）體內(nèi)成熟，經(jīng)超數(shù)排卵處理后，采取成熟卵泡內(nèi)的卵母細胞或從輸卵管內(nèi)回收剛剛排出的卵母細胞；（2)體外成熟，采集卵泡中未成熟的卵母細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)使之成熟。后一種方法可以充分利用母畜的卵巢，是解決卵子來源最有效的途徑，具有更大的實用價值。第22頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）卵母細胞成熟的特征卵母細胞成熟是指充分生長卵母細胞向成熟卵母細胞轉(zhuǎn)化的過程。包括：減數(shù)分裂的恢復(fù)和完成，以及細胞質(zhì)、細胞膜、透明帶和卵丘細胞的成熟變化。第23頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)卵母細胞體外成熟培養(yǎng)方法1.培養(yǎng)液合成培養(yǎng)液如TCM-199(80%)、Ham’sF10和F12。緩沖體系對卵母細胞體外成熟有重要影響。胎牛血清比添加BSA有更高的成熟率。血清含有某種能促進卵母細胞或體外受精的成分，可阻止透明帶硬化和促進受精第24頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2、培養(yǎng)方法在滅菌石蠟油中，制作0.05-0.2mL培養(yǎng)液微滴，1-6個微滴/培養(yǎng)皿。選取A和B級卵母細胞，用培養(yǎng)液洗滌2～3次，移入微滴中，10-15個卵母細胞/微滴，在5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。第25頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）影響卵母細胞體外成熟的因素1.動物種類-卵母細胞結(jié)構(gòu)不同，需要條件也不同。2.卵母細胞供體母畜年齡、性機能及卵巢狀態(tài)-初情期、性成熟卵母細胞。3.卵母細胞類型A級和B級具有較高受精率。4.卵巢運輸、取卵方式和季節(jié)-溫度過低，冷休克。5.培養(yǎng)系統(tǒng)，包括溫度、濕度、空氣環(huán)境和培養(yǎng)基等。第26頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.5精子體外獲能定義：哺乳動物的精子必須在子宮或輸卵管內(nèi)經(jīng)過一定的時間，發(fā)生一定的生理變化，才能獲得穿透卵子的能力，此現(xiàn)象稱為精子獲能。有效的體外獲能技術(shù)是成功地進行體外受精的前提和保證。第27頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）精子體外獲能Ⅰ.精子體外獲能的主要途徑1、高離子強度液2、鈣離子載體3、氨基多糖法Ⅱ.獲能精子的特征及檢測1、獲能精子的特征2、獲能精子的檢測第28頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月Ⅰ.精子體外獲能的主要途徑生殖道液體中存在誘導(dǎo)獲能和頂體反應(yīng)的因子和鈣離子。加入誘導(dǎo)獲能的有效成分：鈣離子載體、氨基多糖、脂類、咖啡因、腎上腺素、cAMP、鞘磷脂酶等。第29頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.高離子強度液置換精子表面抗原物質(zhì)或去能因子，從而誘發(fā)頂體反應(yīng)。2.鈣離子載體精子的頂體反應(yīng)是一個Ca2+依賴過程。鈣離子載體攜帶鈣離子進入精子內(nèi)，可誘發(fā)頂體反應(yīng)并激活頂體酶。3、氨基多糖法（GAGs)GAGs可促進精子對Ca2+的吸取，從而誘發(fā)頂體反應(yīng)。其作用程度有賴于氨基多糖的硫酸化程度。肝素是硫酸化程度最高的GAG，其作用也最強。第30頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）獲能精子的特征及檢測1、獲能精子的特征代謝改變，呼吸代謝明顯增加。運動方式改變，超活化運動。頂體形態(tài)變化，頂體帽部分的質(zhì)膜和頂體外膜在多處發(fā)生融合，膜泡狀化。超活化運動發(fā)生于頂體反應(yīng)之前。第31頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2、獲能精子的檢測運動方式：鏡檢精子活力、運動類型和運動速度。頂體反應(yīng)：頂體反應(yīng)是判斷精子獲能的有效方法之一。電鏡：頭部質(zhì)膜與頂體外膜泡狀化，或僅殘存頂體內(nèi)膜。頂體染色法(三重染色技術(shù))光鏡觀察：品紅色，無頂體反應(yīng)。白色，有頂體反應(yīng)。藍黑色，死精子棕色，活精子。頂體帽頂體后區(qū)第32頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.6體外受精將獲能精子與成熟卵子置于受精液中共同培養(yǎng)，使之完成受精過程。影響因素：精子濃度精卵相遇的時間操作：石蠟油中懸浮0.1mL小液滴（精液），移入10-15枚成熟卵母細胞/小液滴，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚。第33頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.7研究意義1.7.1.基礎(chǔ)研究領(lǐng)域再現(xiàn)體內(nèi)受精過程，揭示受精的本質(zhì)和機理，研究胚胎的分化和發(fā)育。1.7.2.應(yīng)用研究領(lǐng)域治療不孕癥。胚胎工廠化生產(chǎn)，為胚胎移植業(yè)開辟胚胎來源。保護珍稀動物種質(zhì)資源。第34頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2.胚胎移植2.1定義:胚胎移植(EmbryoTransfer)又稱受精卵移植，俗稱借腹懷胎，是指將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。第35頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月Embryotransferreferstoastepintheprocessofassistedreproductioninwhichembryosareplacedintotheuterusofafemalewiththeintenttoestablishapregnancy.Thistechnique(whichisoftenusedinconnectionwithinvitrofertilization(IVF)),maybeusedinhumansorinanimals,inwhichsituationsthegoalsmayvary.第36頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2.2胚胎移植的發(fā)展歷史1890年，Heape在英國劍橋大學(xué)首次報道獲得兔子胚胎移植成功。20世紀(jì)30年代后開始大量研究，1951年willett首次成功地進行了牛的胚胎移植。1974年，第一頭胚胎移植的何斯坦奶牛在美國出生。1976年，一些研究小組報道了采用導(dǎo)管高效采集胚胎的非手術(shù)方法，隨后胚胎移植在奶牛中的應(yīng)用得到飛速發(fā)展。我國對牛胚胎移植研究起步較晚，1978牛手術(shù)法胚胎移植犢牛降生，1980年非手術(shù)法移植成功，1982年冷凍胚胎移植成功。第37頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2.3胚胎移植的基本原則1.胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性（1）供體和受體在分類學(xué)上屬于同一物種（2）胚胎發(fā)育階段與受體發(fā)情時間上的一致性（3）胚胎發(fā)育階段與受體生殖道解剖位置的一致性2.胚胎質(zhì)量3.經(jīng)濟效益和科學(xué)價值第38頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4胚胎移植技術(shù)程序及操作供體和受體的選擇超數(shù)排卵處理供體母畜的配種胚胎的收集胚胎的檢查胚胎的保存與培養(yǎng)胚胎的移植供體和受體的術(shù)后觀察第39頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月×ET胚胎收集質(zhì)量檢查受體母牛同期發(fā)情胚胎移植程序示意圖第40頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)流程圖第41頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4.1供體和受體的選擇供體應(yīng)具有遺傳優(yōu)勢，良好的育種價值；供體應(yīng)具有良好的繁殖能力；供體應(yīng)營養(yǎng)良好，體質(zhì)健壯，健康無疾病；受體具有良好的繁殖機能，體質(zhì)健康；供受體發(fā)情時間應(yīng)接近或一致（24小時之內(nèi)）。第42頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4.2胚胎的采集采集時間的確定：發(fā)育時程采集方法：

手術(shù)法采集：適應(yīng)范圍廣非手術(shù)法采集：牛、馬第43頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4.3胚胎的檢查和鑒定胚胎的分級A