成分測定方法

1-GC-MS分析揮發(fā)油的測定知岫gggg700DI30Qfiunnooa；SfltXKLDDf加MJ賊3DOQOQQZVBUWUTDnOOOCiTTm*—?3_dD圖1川苓揮發(fā)油GC-MS成分分析色譜圖Fig1TheGCMSchromatogramoftheessentialoilofchuanxiong川芍揮發(fā)油化學(xué)成分分析取川芍揮發(fā)油適量，加無水乙醇溶解并稀釋至約0.lmg/mL,取該溶液注入GC一MS進行分析測定。色譜柱采用鍵合甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱(30mX0.25mmX0.25um)，以氦氣為載氣，柱溫使用程序升溫，升溫程序為:40°C保持3min后，以4'C/min的速度升高至200°C,并保持10min。進樣口溫度為230C,離子源溫度為200'C,電子轟擊電離能量是70eV。分析數(shù)據(jù)連續(xù)采集30min,所得總離子流圖如圖1所示。經(jīng)過GC一MS測定,共測得該川芍揮發(fā)油中含有29種成分,根據(jù)保留時間以及對照質(zhì)譜譜庫，得到其主要為Z一藁本內(nèi)酯(Z一ligustilide)(t=14.37min),E—藁本內(nèi)酯(E一Iigustilide)(t=14.95min),正丁烯基苯歐(butylidenephthalide)(t=14.20min),環(huán)氧藁苯內(nèi)酯(ePoxyligustilide)(t=13.62min),丁基苯歐(butylphthalide)(t=13.58min),a一萜品醇(a—terpineol)(t=7.16min),其余成分為萜烯類及其衍生物以及一些小分子化合物。注：在GC-MS分析中，色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集是同時進行的。(摘自中藥川芎揮發(fā)性成分析及藥代動力學(xué)研究第二軍醫(yī)大學(xué))2-RP-HPLC法測定藁苯內(nèi)酯的含量1.藁本內(nèi)酯對照品儲備液及供試品溶液的制備精密稱量藁苯內(nèi)酯對照品11.84mg置50mL棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液，低溫避光保存?zhèn)溆?。分別精密稱量當(dāng)歸揮發(fā)油I和當(dāng)歸揮發(fā)油II7.46mg和3.44mg，分別置25mL的棕色容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，低溫避光保存，作為供試品溶液。2色譜條件色譜柱：linertsilODS-3(250mmX4.6mm，5pm)；C18保護柱：(10mmX4.6mm)；流動相：乙腈-水=78:22(v/v)；流速：1.0mL?min-1；檢測波長：280nm；進樣量：20pL，柱溫：25°C。3色譜系統(tǒng)適用性分別取適當(dāng)濃度的藁苯內(nèi)酯對照品30%乙醇-生理鹽水溶液、當(dāng)歸揮發(fā)油乙醇溶液、12h時間點的透皮接收受液，在上述色譜條件下分別進樣，記錄色譜圖。藁苯內(nèi)酯色譜峰基線分離完全，藁苯內(nèi)酯的保留時間為7.6min，透皮接收液中的其它成分及當(dāng)歸揮發(fā)油中其他成分不干擾藁苯內(nèi)酯的測定，溶劑乙醇與30%乙醇-生理鹽水對藁苯內(nèi)酯的測定無顯著影響。4標(biāo)準曲線制備與線性范圍精密量取藁苯內(nèi)酯對照品儲備液21.56mL于50mL的棕色容量瓶中，加30%乙醇-生理鹽水至刻度，搖勻既得100.0pg?mL-1藁苯內(nèi)酯對照品溶液，用30%乙醇-生理鹽水倍比稀釋成0.5000，1.000，5.000，10.00，20.00，40.00，60.00，80.00pg?mL-1藁本內(nèi)酯對照品溶液。色譜條件下進樣分析，記錄藁本內(nèi)酯色譜峰面積。以藁本內(nèi)酯色譜峰面積Y對藁本內(nèi)酯標(biāo)準品濃度C(pg-mL-1)進行線性回歸。L'.pgniL1圖L2藁苯內(nèi)醋I：作曲線回歸方程為:Y=45326C-10672(r=0.9998,n=5),線性范圍為0.5000?80.00pgmL-15精密度實驗取低、中、高三個濃度的藁苯內(nèi)酯對照品30%乙醇-生理鹽水溶液(1.000、10.00、60.00pg?mL-1)同1d連續(xù)進樣5次，記錄峰面積，計算藁苯內(nèi)酯的日內(nèi)相對標(biāo)準誤差(RSD)。連續(xù)3d進樣5次，記錄峰面積，計算藁苯內(nèi)酯的日間RSD。結(jié)果見表1-1。TT十皿八十小―寸-件丁6人0.1-1藁苯內(nèi)施額一法精密度3=5)時|府IIi」JIJH11內(nèi)測f.丁派度(■住mL'1)11內(nèi)RSD1%)日間測得濃度11fidRSD1.00()J2J9±0.0037().30631.217^().0(M[0.33410.0()J0.29±O.JOOOO.[)72K10.25二().1217L.LSK60一00叫10二0.424K().7IKK二0.20470.34526穩(wěn)定性試驗當(dāng)歸揮發(fā)油II乙醇溶液在配制后1，4,6,8,12h進樣分析，測定藁苯內(nèi)酯峰面積的RSD=3.09%，表明當(dāng)歸揮發(fā)油乙醇溶液在本實驗體系下12h內(nèi)比較穩(wěn)定。7加樣回收率精密量取同一批已知藁苯內(nèi)酯含量的1.346mg?mL-1當(dāng)歸揮發(fā)油II乙醇溶液1.0mL平行6份，分成3組，每組2份，分別加入232.0pg-mL-1藁苯內(nèi)酯對照品溶液0.50,1.0,3.0mL。乙醇溶解定量至25mL,得藁苯內(nèi)酯理論濃度分別為34.67、39.30、57.46pg?mL-1的溶液，搖勻，色譜條件下分別進樣分析，記錄色譜圖，計算低、中、高種濃度的加樣回收率及RSD見表1-2。^1-2集苯內(nèi)酯的加樣|可收率樣品取樣量（ni&）樣品含量（瞄掀品加入量侮）測得量1可收率（%）平均均收率（%）RSDm)1.346750.62116.()115.9299.931.346750.62116.()116.08100.071.346750.62232.()232.87100.38100.10.18011.346750.62232.()232.35100.151.346750.62695.4799.921.346750.62695.8199.978兩種當(dāng)歸揮發(fā)油中藁苯內(nèi)酯的含量測定分別精密稱量71.27mg當(dāng)歸揮發(fā)油I和6.73mg當(dāng)歸揮發(fā)油II,無水乙醇溶解并定溶于50mL棕色容量瓶中；分別取藁苯內(nèi)酯對照品溶液和當(dāng)歸揮發(fā)油溶液各20以L,色譜條件下各平行測定5次，記錄藁苯內(nèi)酯峰面積。依據(jù)回歸方程計算當(dāng)歸揮發(fā)油中藁苯內(nèi)酯的含量，當(dāng)歸揮發(fā)油I中藁苯內(nèi)酯含量含量為6.96mg?g-1,當(dāng)歸揮發(fā)油II中藁苯內(nèi)酯含量含量為556.02mg?g-13HPLC法同時測定當(dāng)歸中阿魏酸和藁苯內(nèi)酯的含量的方法1儀器與試劑高效液相色譜儀，超聲清洗器，SPSS11.5數(shù)據(jù)分析軟件。甲醇，乙月青（色譜純），純凈水（娃哈哈），冰乙酸，磷酸（分析純）阿魏酸對照品，藁本內(nèi)酯對照品2方法與結(jié)果對照品溶液的制備精密稱取阿魏酸5.17mg，加乙青制成每1ml分別含0.517ug的儲備溶液,20.68ug的對照溶液；精密稱取藁本內(nèi)酯10.14mg對照品，加乙青制成每1ml分別含1.014ug的儲備溶液202.8ug的對照溶液3色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以流動相乙青（A）1%的乙酸水溶液（B）洗脫，洗脫梯度為0?15min,38%A,15?20min,38%?70%A,20?40min,70%A,檢測波長323nm，柱溫為室溫；流量1.0ml-min4對照品線性關(guān)系考察分別準確量取阿魏酸，藁本內(nèi)酯對照品儲備液適量，用乙青稀釋成6個濃度的系列混合對照品溶液，以各對照品峰面積（A）對濃度（C）進行線性回歸，阿魏酸A=57247C+4356.0（r=0.9994）線性范圍10.34~206.8ug,藁本內(nèi)酯A=17901C+13305（r=0.9996），線性范圍104.1?2535.0ug5精密度考察按1項下方法制備當(dāng)歸樣品供試溶液，連續(xù)進樣5次，結(jié)果各次進樣的阿魏酸，藁本內(nèi)酯峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為1.6%,3.0%6重復(fù)性考察按1項下方法制備當(dāng)歸樣品供試溶液5份，分別進樣，結(jié)果5份樣品的阿魏酸,藁本內(nèi)酯峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3.0%7穩(wěn)定性考察按1項下方法制備當(dāng)歸供試品溶液，分別在0,2,4,10,1620,24h測定阿魏酸，藁本內(nèi)酯峰的峰面積，結(jié)果阿魏酸，藁本內(nèi)酯峰的峰面積的RSD均＜3.0%8測定法分別吸取供試品溶液10ul，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得$混合對照品和樣品色譜圖見圖0 1。M擁41) 54)包nin20sc'''HS60f/niin?「對■品;k樣品;l.阿覿陋；n藁奉內(nèi)酷

圖|當(dāng)歸樣品色譴(摘自30批當(dāng)歸中阿魏酸、藁本內(nèi)酯含量測定蘭州大學(xué)).4熟地黃的TLC鑒定1藥液的制備樣品溶液的制備四物湯原液、55%醇沉上清液、ZTCI+l澄清后的藥液、D101大孔吸附樹脂40%醇沖液，，按本實驗四物湯的提取工藝和各個純化工藝的方法制備(1:1:1:1)，取上述相當(dāng)于4g生藥的各組藥液，藥液濃度為0.1g/m1,加乙酸乙酯120ml萃取，回收乙酸乙酯至1ml,備用。2熟地黃對照溶液的制備取熟地黃1g,加水50ml,水煮30min，濾過，濃縮到10ml,加乙酸乙酯30ml萃取，回收乙酸乙酯至1ml,備用。3陰性對照溶液的制備取當(dāng)歸、川芍、白芍各1g,加水150ml,水煮30min，濾過，濃縮到30ml,加乙酸乙酯90ml萃取,回收乙酸乙酯至1ml,備用4TLC檢測分別吸取上述各個藥液點于同一硅膠GF254薄層板上,以石油醚(60—90°C)一醋酸乙酯(1:1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。各個樣品色譜中,在與熟地黃對照色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性對照溶液在相應(yīng)的位置上沒有斑點。結(jié)果見下圖10圖“四物湯中熟地黃的TLC檢測圖1：陰性2：熟地黃3：四物湯原液4： 人孔吸附樹脂40%辭沖液5S5%釁沉上清液6ZTCHI澄潔行的西液5結(jié)果分析1經(jīng)三種工藝純化后的藥液都能檢測到熟地黃的斑點，而陰性對照沒有此斑點，文獻報道此斑點為5一輕甲基一糠醛。2本實驗曾對梓醇進行HPCL分析,發(fā)現(xiàn)很難對它進行含量測定，原因可能有以下幾點：文獻〔2)報道熟地黃中的梓醇含量在0.04%左右，經(jīng)過長時間的水煮后四物湯中含量可能在0.01%以下。梓醇為環(huán)烯醚菇類化合物，梓醇在水中最大的吸收波長為194nm，由于是位于低波長區(qū)，故一般選擇0.6%—2%的乙腈水溶液為流動相，檢測波長為210nm，210nm并非梓醇的最大吸收波長，其靈敏度很低。梓醇在流動相為0.6%—2%的乙腈水溶液分離度并不好本實驗中曾聯(lián)合應(yīng)用正丁醇萃取和D101大孔吸附樹脂法純化四物湯提取液，達到除去大量的低極性和極性的雜質(zhì),濃縮成生藥濃度為的20g/m1，過濾，HPLC檢測梓醇的峰面積還是很小，并且分離度并不好，沒有達到滿意的效果,所以本實驗沒有檢測梓醇來控制四物湯中熟地黃中的質(zhì)量，而選用TLC法定性檢測四物湯中的熟地黃。5芍藥苜的HPLC方法學(xué)考察1色譜條件色譜柱Diamonsi1T'(鉆石)C，，sum，250x4.6mm，流動相芍藥苷為甲醇:水:冰醋酸:異丙醇(25:71:2:2)，流速1.0ml/min，檢測波長230nm，柱溫35°C，理論塔板數(shù)按芍藥苷計算不低于2500。2溶液的制備1對照品溶液的制備分別精密稱取芍藥苷對照品5.52mg(即，可買試劑)，加水制成每1m1含0.2208mg的溶液搖勻,備用。2供試品溶液的制備量取2.1.2項下(即：四物湯樣品的提取以處方比例取藥材當(dāng)歸25g、川芍25g,次加水量各為8倍量，煎煮1.5小時，合并煎液,濾過,濾液濃縮成每毫升相當(dāng)于0.5g藥材的藥液,加入95%的乙醇溶液使醇的濃度達到55%,邊加邊攪拌，使其均勻分散，然后冷藏(4’C左右)24h,3000r離心10min，得上清液,加小量的55%醇于沉淀物中再離心，合并上清液，減壓回收乙醇濃縮成稠膏備用。）相當(dāng)于5g生藥量的藥液，置250ml的容量瓶中，用水溶解并定容之刻度,作為每lml含有0.02g生藥的供試品溶液。3芍藥苷線性關(guān)系考察分別精密吸取上述對照品溶液1,2,3,4,5ml,加入10ml的容量瓶，定容之刻度，分別注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件進行測定。以峰面積（mAU）Y對芍藥苷量（ug）X進行回歸分析,得回歸方程y=436807X—9818.1,r=0.999表明在芍藥苷0.2208ug一1.104ug范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖5圖5芍藥昔標(biāo)準曲線4精密度試驗取同一對照品溶液，連續(xù)進樣5次，測定芍藥苷峰面積積分值，結(jié)果見表4表4芍藥昔精密度試驗結(jié)果序號峰面積積分值峰面積均值RSD(%)140482623888843380293391960.52.25438166953905296405562

5重復(fù)性試驗按上述供試品溶液的制備方法制備供試品溶液6份,按上述色譜條件進行分析,精密吸取10ul，進樣分析，結(jié)果見表5 RSD=2.87(n=6)表5芍藥昔重現(xiàn)性試驗結(jié)果進樣次數(shù)峰面積積分值峰面積平均值RSD%137104423679033374853371293.32.87%4330316535231463913306陰性對照試驗:按處方投料(不加白芍藥材)，按“2.1供試品制備”進行操作，制備陰性對照樣品,按上述供試品溶液的制備方法操作。結(jié)果表明,陰性對照品