甾體激素類藥物分析 全國優(yōu)質(zhì)課一等獎

P2-6甾體激素類藥物的分析教學(xué)標(biāo)準(zhǔn)知識目標(biāo)：藥物的分類及基本結(jié)構(gòu)以及可供分析的官能團(tuán)；鑒別試驗；特殊雜質(zhì)檢查和含量測定。技能目標(biāo)：掌握本類藥物的分類及基本結(jié)構(gòu)以及可供分析的官能團(tuán)；熟悉常用的鑒別試驗及特殊雜質(zhì)檢查法；掌握比色分析法(四氮唑比色法、異煙肼比色法及柯柏反應(yīng)比色法)；熟悉HPLC法及其在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用。什么是激素？激素（Hormone，荷爾蒙）----是人體內(nèi)各種內(nèi)分泌腺所分泌的一種生物活性物質(zhì)。激素作用于特定的稱為靶器官的組織、細(xì)胞上而發(fā)揮作用。如果激素分泌出現(xiàn)平衡失調(diào)，可使人體發(fā)生病變，如甲亢、糖尿病等?；窘Y(jié)構(gòu)和分類甾體激素類藥物均具有環(huán)戊烷駢多氫菲母核，基本骨架為：一、腎上腺皮質(zhì)激素常用的有氫化可的松、醋酸可的松、醋酸潑尼松等。結(jié)構(gòu)特點：①A環(huán)3位為羰基、4，5位間為雙鍵，形成共軛體系，標(biāo)記為：Δ4-3-酮基（又稱α、β不飽和酮結(jié)構(gòu)），或?qū)懗?Δ4-C3=O；②C環(huán)11位上有羰基或羥基；③D環(huán)17位上有α-醇酮基側(cè)鏈（），并且多數(shù)還具α-羥基。二、雄性激素及蛋白同化激素（1）臨床常用的雄性激素為睪丸素（睪酮）的衍生物，如丙酸睪丸素、苯乙酸睪丸素。（2）常用的蛋白固化激素有苯丙酸諾龍（苯丙酸去甲睪酮）、康力龍、康復(fù)龍等。（1）結(jié)構(gòu)特征（兩種激素之共同點）：①A環(huán)3位Δ4-3-酮基（又稱α、β不飽和酮結(jié)構(gòu)）；②D環(huán)17位上無側(cè)鏈，多為羥基。（2）兩種激素結(jié)構(gòu)之不同點：蛋白同化激素10位上大多無角甲基，有的4位有鹵素。三、孕激素又稱黃體素或孕酮，臨床上主要為黃體酮、己酸孕酮、安宮黃體酮和甲地孕酮等。①A環(huán)Δ4-3-酮基（α、β不飽和酮結(jié)構(gòu)）；②D環(huán)17位上有甲基酮，有些具有羥基；四、雌激素臨床上常用雌二醇及其各種酯和炔雌醇及其衍生物，以及活性的雌酮、雌三醇等。①A環(huán)為苯環(huán)，3位上有酚羥基，10位無角甲基；②D環(huán)17位上有羥基或羰基，有的還有乙炔基。腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素與蛋白同化激素雌激素孕激素C3C3＝OΔ4-3=O或Δ1，4-3＝OC3＝OΔ4-3=OC3－OHA環(huán)為苯環(huán)C3＝OΔ4-3=OC10C13有兩個角甲基有的兩個有的一個（C13）C13有一個有兩個角甲基C17α－醇酮基－OH或其酯－OH或有－C=CH甲酮基鑒別試驗一、化學(xué)鑒別法（一）與強酸的呈色反應(yīng)（甾核）許多甾體激素可與硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸等呈色，主要與硫酸等呈色，機理可能是酮基的質(zhì)子化反應(yīng)。方法：取樣品少許觀察顏色、熒光

再觀察鑒別試驗一、化學(xué)鑒別法（一）與強酸的呈色反應(yīng)（甾核）許多甾體激素可與硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸等呈色，主要與硫酸等呈色，機理可能是酮基的質(zhì)子化反應(yīng)。方法：取樣品少許，加硫酸，觀察顏色、熒光，加水稀釋后再觀察。（二）官能團(tuán)的反應(yīng)1、C17－α－醇酮基的反應(yīng)皮質(zhì)激素C17-α-醇酮基具有還原性，能與許多氧化劑，如氨制AgNO3、斐林試劑、四氮唑鹽反應(yīng)。其中以四氮唑鹽的顯色反應(yīng)最為常用，不但可用作層析法的顯色劑，還可用于含量測定。1、與堿性酒石酸銅試液反應(yīng)

銅（Ⅱ）在堿性條件下可被還原物質(zhì)還原為紅色的氧化亞銅沉淀。如：中國藥典鑒別氫化可的松2、與氨制硝酸銀試液的反應(yīng)

銀（Ⅰ）在堿性條件下可被還原物質(zhì)還原為黑色的金屬銀沉淀。如：中國藥典鑒別醋酸去氧皮質(zhì)酮3、與堿性四氮唑鹽顯色反應(yīng)

氯化三苯四氮唑（或藍(lán)四氮唑）在堿性條件下可被還原物質(zhì)還原為紅色的單甲鐕（或藍(lán)色的雙甲鐕）。2、酮基的呈色反應(yīng)機理：分子中C3=O和C20=O能與一般羰基試劑如：2，4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼等顯色。主要是C3=O與異煙肼縮合生成異煙腙而呈黃色。鹽酸酸性條件下：

Δ4-3＝O：即刻反應(yīng)

Δ1，4-3＝O：1～3minC20＝O：長時間3、甲酮基或活性亞甲基的反應(yīng)含H3C-C=O（甲酮基）和活性亞甲基的激素類藥物與亞硝基鐵氰化鈉、芳香醛、間二硝基苯反應(yīng)呈色。（1）甲酮基的呈色反應(yīng)：如黃體酮與亞硝基鐵、氰化鈉呈藍(lán)紫色，其它甾體呈淡橙色或不顯色。（專屬反應(yīng)）（2）亞甲基的反應(yīng)：如硫酸普拉睪酮與乙醇間二硝基苯、氫氧化鈉呈紫紅色4、酚羥基的呈色反應(yīng)：A環(huán)為苯環(huán)的雌激素+重氮苯磺酸鹽,生成紅色偶氮染料。H+5、炔基的沉淀反應(yīng)含炔基的甾體激素，如炔雌醇、炔諾酮，遇硝酸銀試液，即生成白色的炔雌醇銀鹽沉淀及白色炔諾酮銀沉淀。6、鹵素的反應(yīng)（有機氟的呈色反應(yīng)）一些含有氟的甾體激素藥物（如醋酸氟輕松、醋酸地塞米松等），以氧瓶燃燒后生成無機氟化物，再與茜素氟藍(lán)及硝酸亞鈰起呈色反應(yīng)。7、酯的反應(yīng)一些甾體激素類藥物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的結(jié)構(gòu)，可先行水解，根據(jù)水解產(chǎn)物來鑒別。本類藥物C17或C21位上羥基的酯，可發(fā)生水解反應(yīng)，生成相應(yīng)的酸與醇，如為醋酸酯，水解后生成的醋酸可與乙醇反應(yīng)，生成有香氣醋酸乙酯。戊酸或己酸酯類水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，進(jìn)行鑒別。二、制備衍生物測定熔點利用甾醇、甾酮類藥物與一些試劑反應(yīng)生成酯、肟、縮氨脲，或用醇制堿液水解甾體酯類生成相應(yīng)的母體，然后測定它們的熔點進(jìn)行鑒別。（一）縮氨基脲的生成如苯丙酸諾龍（甾酮）+縮氨脲苯丙酸諾龍縮氨脲（二）酯的水解如丙酸睪丸素睪丸素三、紫外分光光度法一些甾體激素藥物分子中存在共軛系統(tǒng)，所以在紫外光區(qū)有特征吸收。四、紅外吸收光譜一般是將供試品所繪制的IR光譜與藥典附錄中收載的標(biāo)準(zhǔn)IR圖譜進(jìn)行對照比較（多采用KBr壓片法），完全一致者即為同一藥物。五、薄層色譜主要用于甾體激素的鑒別、純度檢查及含量測定前分離和制劑穩(wěn)定性研究，具有簡便、快速、靈敏、分離度高等優(yōu)點。六、高效液相色譜法在一定的色譜條件下，比較甾體激素樣品與其對照品峰的保留時間進(jìn)行鑒別。一般都規(guī)定在含量測定項下的高效液相色譜圖中，供試品峰的保留時間進(jìn)行應(yīng)與對照品峰的保留時間一致。特殊雜質(zhì)檢查甾體激素類藥物多由其它甾體化合物或結(jié)構(gòu)類似的其它甾體激素經(jīng)結(jié)構(gòu)改造而來，所以可能帶來原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物以及試劑和溶劑等雜質(zhì)。有些雜質(zhì)與該甾體激素藥物結(jié)構(gòu)類似，也具有一定的藥理作用而又互不相同，因此在甾體激素類藥物的質(zhì)量控制中，“其他甾體”的限度檢查顯得很重要。一、其它甾體的檢查我國藥典和一些國家近版藥典，采用TLC法或HPLC法檢查甾體激素類藥物中的“其它甾體”。因為該法具有簡便、快速、靈敏、分離效果好等優(yōu)點，而廣泛用于甾體激素藥物的鑒別、檢查結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)等質(zhì)量控制的方法。采用高低濃度對比法進(jìn)行，即供試液與對照液均為同一物，但僅濃度有所不同。結(jié)果判斷：中國藥典正文中對供試品規(guī)定了雜質(zhì)斑點數(shù)目和每個雜質(zhì)斑點不得超過的限量。二、硒的檢查本類中一些藥物在后工序用二氧化硒脫氫，故應(yīng)檢查硒。三、殘留溶劑檢查（甲醇和丙酮的檢查）此為地塞米松磷酸鈉殘留溶劑檢查，中國藥典采用GC法檢查。四、游離磷酸鹽的檢查本法系利用在酸性溶液中磷酸鹽中磷酸鹽與鉬酸銨作用生成磷鉬酸銨，再經(jīng)過還原形成磷鉬酸藍(lán)（鉬藍(lán)）在740nm處有最大吸收。含量測定常用方法有容量法、比色法、紫外分光光度法、熒光法、氣相色譜法、高效液相色譜等。其中紫外分光光度法、四氮唑鹽比色法、異煙肼法、鐵-酚試劑比色法及HPLC法在藥典中均有收載。一、高效液相色譜法各國藥典采用反相高效液相法測定，方法一般為內(nèi)標(biāo)法。填充劑為十八烷基硅烷化鍵合硅膠；流動相多為甲醇-水、乙腈-水-異丙醇、甲醇-四氫呋喃-水等混合溶劑；檢測器均為紫外光檢測器，檢測波長為240nm或254nm。為了提高分離效率、獲得滿意的峰形，有時在流動相中加入醋酸緩沖液或磷酸緩沖液調(diào)節(jié)流動相的pH值。二、紫外分光光度法本類藥物分子結(jié)構(gòu)中有共軛體系△4-3-酮、△1，4-3-酮、苯環(huán)、酚羥基等結(jié)構(gòu)。如皮質(zhì)激素、雄性激素、孕激素及口服避孕藥中有分子中α、β不飽和酮結(jié)構(gòu)，在紫外光區(qū)240nm附近有最大吸收；具有苯酚結(jié)構(gòu)的雌激素在280nm附近有最大吸收，均可用紫外分光光度法測定含量。三、比色法（一）異煙肼比色法1、方法原理甾體激素C3上酮基及某些其它位置上的酮基都能在酸性條件下與羰基試劑如異煙肼、2，4-二硝基苯肼及氨基脲等起縮合反應(yīng)，可作為含量測定的依據(jù)。異煙肼是目前廣泛采用的一種，異煙肼（INH）試劑可與一些甾酮在酸性條件下形成黃色異煙腙，在一定波長處具有最大吸收。某些具有△4-3-酮和C20－酮基的甾體激素可形成雙腙，如黃體酮、可的松、氫化可的松等。2、測定方法分別制備供試品、對照品溶液，再分別與異煙肼溶液反應(yīng)，在420nm波長處分別測定吸收度并計算結(jié)果。（二）四氮唑比色法1、反應(yīng)原理皮質(zhì)激素C17-α-醇酮基具有還原性，在強堿性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲鐕。生成的顏色隨所用試劑和條件的不同而定，多為藍(lán)色或紅色。（三）Kober反應(yīng)比色法1、方法原理雌激素的含量測定，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用Kober反應(yīng)。該法是雌激素在硫酸的作用下，通過質(zhì)子化、分子重排、脫氫等作用形成共軛多烯而顯色。反應(yīng)分為以下兩步:①被硫酸氧化而形成黃色產(chǎn)物；②加水或稀硫酸稀釋后繼續(xù)氧化最終形成紅色產(chǎn)物。2、測定方法：炔雌醇片四、生物樣品中甾體激素的分析本類藥物的藥代學(xué)研究、生物利用度研究及違禁藥物監(jiān)測等均需測定生物樣品中的甾體激素藥物。生物樣品中本類藥物的分析要求方法的專屬性強、靈敏度高，因本類藥物的給藥劑量小，血藥濃度很低（ng級或更低）。體內(nèi)有內(nèi)源性的甾體激素，故測定方法多采用GC、HPLC法測定，特別是采用GC-MS、HPLC-MS法。使用MS作為檢測器，分析方法的專屬性和靈敏度更高。采用GC-MS法對諾龍等19種蛋白同化激素的人體代謝進(jìn)行了研究。幾種測定方法的特點及其應(yīng)用方法名稱測定基團(tuán)主要試劑甾體類別高效液相色譜法Δ4-3=O或芳香A環(huán)C18柱甲醇（乙腈）－水各類甾體激素紫外分光光度法Δ4-3=O或Δ1，4-3＝OA環(huán)為芳香環(huán)溶劑（無水乙醇、乙醇、甲醇）腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素雌性激素口服避孕藥四氮唑比色法C17－