原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

關(guān)于原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控第1頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)基本問(wèn)題：1、蛋白質(zhì)如何識(shí)別DNA的結(jié)合位點(diǎn)？2、轉(zhuǎn)錄的抑制或增強(qiáng)是如何進(jìn)行的？第2頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控第3頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月重要的概念1、反式作用因子和順式作用元件2、結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因3、正調(diào)控和負(fù)調(diào)控4、單順?lè)醋雍投囗樂(lè)醋?、異構(gòu)調(diào)控第4頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反式作用因子和順式作用元件基因的轉(zhuǎn)錄活性主要通過(guò)反式作用因子（trans-actingfactor）和順式作用元件（cis-actingelement）之間的特異相互作用來(lái)調(diào)節(jié)。反式作用因子為蛋白質(zhì)。例如：RNA聚合酶順式作用元件為DNA。例如：?jiǎn)?dòng)子和終止子第5頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反式作用和順式作用的概念反式作用順式作用第6頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）：編碼RNA或蛋白質(zhì)（包括結(jié)構(gòu)蛋白、酶和調(diào)控蛋白）的基因；調(diào)控基因（regulatorgene）:編碼調(diào)控蛋白（regulatorprotein）的基因，參與調(diào)控一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。調(diào)控蛋白通過(guò)結(jié)合在DNA的特定位點(diǎn)以調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。

靶基因位點(diǎn)第7頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月調(diào)控蛋白激活蛋白（activator）：增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白（repressor）：抑制轉(zhuǎn)錄操縱基因，調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)第8頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9調(diào)控蛋白缺失:基底轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控（negativeregulation）：阻遏蛋白結(jié)合DNA抑制基因表達(dá)正調(diào)控（positiveregulation）：激活蛋白結(jié)合DNA增強(qiáng)基因表達(dá)正調(diào)控和負(fù)調(diào)控第9頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單順?lè)醋樱╩onocistonicmessage）和多順?lè)醋樱╬olycistonicmessage）第10頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月異構(gòu)調(diào)控（allostery

regulation)許多調(diào)控蛋白都是變構(gòu)蛋白(allostericprotein)，通過(guò)與效應(yīng)物結(jié)合改變構(gòu)象而改變活性，起到調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用，即異構(gòu)調(diào)控第11頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控策略：將功能相關(guān)的基因集合成組，這樣易于整體調(diào)控。&相互臨近、協(xié)同調(diào)控的一組基因的被稱為操縱子（operon）。如：lac操縱子&非臨近但協(xié)同調(diào)控的一組基因的被稱為調(diào)節(jié)子如：mal調(diào)節(jié)子第12頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月操縱子與乳糖操縱子1.提出：1961年,Jacob

（雅格布）-Monod（莫諾）.2.操縱子(operon)：操縱子是原核生物基因表達(dá)和調(diào)控的單元，典型的操縱子包括：結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控元件和調(diào)節(jié)基因。大腸桿菌K12中共有4136個(gè)基因，以操縱子結(jié)構(gòu)存在的基因接近1/4（256操縱子，控制879基因）第13頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月操縱子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因：控制某一代謝途徑關(guān)鍵酶的多順?lè)醋?。調(diào)控元件：?jiǎn)?dòng)子和操縱區(qū)（覆蓋在啟動(dòng)子和編碼區(qū)交叉區(qū)，是阻遏調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)）。調(diào)節(jié)基因：獨(dú)立編碼蛋白質(zhì)的基因。

調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物結(jié)合調(diào)控元件，抑制或激活結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。第14頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳糖操縱子ThelacZ,lacY,lacAgenesaretranscribedintoasinglelacZYAmRNA(多順?lè)醋?underthecontrolofasinglepromoterPlac

.操縱基因，又稱操作子(operator)，為順式調(diào)控元件，不編碼任何產(chǎn)物！第15頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌生長(zhǎng)特點(diǎn)環(huán)境變化營(yíng)養(yǎng)供給能量消耗最低化

當(dāng)某種物質(zhì)不存在時(shí)，細(xì)菌就不合成該物質(zhì)代謝途徑中的酶；而當(dāng)該物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，立即合成所需的代謝酶。這種當(dāng)特定底物出現(xiàn)才合成特定酶的過(guò)程稱為誘導(dǎo)（induction）。細(xì)菌能夠快速做出應(yīng)答，迅速?gòu)睦靡环N物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N物質(zhì)第16頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雙峰生長(zhǎng)(diauxicgrowth)E.coli

生長(zhǎng)在含有葡萄糖（glucose）和乳糖（lactose）的培養(yǎng)基上。細(xì)胞首先利用葡萄糖快速生長(zhǎng)，直至葡萄糖耗盡。隨后，細(xì)胞停止生長(zhǎng)，“調(diào)整”以適應(yīng)新的營(yíng)養(yǎng)源——乳糖。延滯期：約1小時(shí)開(kāi)啟lac操縱子，積累乳糖代謝所需要的酶第17頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在正常情況下，E.coli是以葡萄糖作為碳源的，葡萄糖是單糖，E.coli利用它最為方便和經(jīng)濟(jì)。在沒(méi)有葡萄糖，只有乳糖存在的條件下，E.coli也能以乳糖為碳源而生存。

乳糖是雙糖，是葡萄糖和半乳糖的復(fù)合物。以乳糖為碳源必須先將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，再將半乳糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，這就需要額外的酶。

結(jié)果解讀第18頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌開(kāi)始乳糖代謝所需要的酶1、將乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖通透酶2、乳糖代謝：分解乳糖（二糖）分解為單糖b-半乳糖苷酶3、β-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，作用不明。在有葡萄糖存在時(shí)，細(xì)菌體內(nèi)的這三種酶含量很低。每個(gè)細(xì)胞中只有3－5個(gè)分子的β—半乳糖昔酶。當(dāng)培養(yǎng)基中沒(méi)有葡萄糖而有乳糖存在時(shí)，這三種酶的量急劇增加，2－3分鐘內(nèi)即可增加1000倍以上，而且三種酶成比例增加。一旦乳糖用完，在2－3分鐘內(nèi)這三種酶的量又很快下降到本底水平。第19頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月啟動(dòng)子PlaclacZlacAlaclOlaclacY調(diào)控元件結(jié)構(gòu)基因

β-半乳糖通透酶β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶

調(diào)節(jié)基因操縱基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄單元lacZYAPlacI啟動(dòng)子第20頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月lacZ乳糖/半乳糖苷半乳糖葡萄糖b-半乳糖苷鍵b-半乳糖苷酶異乳糖b-半乳糖苷酶催化側(cè)鏈反應(yīng)使乳糖重排，形成異乳糖（誘導(dǎo)物）第21頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月lacYlacA第22頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第23頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月啟動(dòng)子PlaclacZlacAlaclOlaclacY調(diào)控元件結(jié)構(gòu)基因

β-半乳糖通透酶分解乳糖半乳糖和葡萄糖運(yùn)送乳糖透過(guò)細(xì)胞壁乙酰輔酶A乙酰半乳糖β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶

乳糖轉(zhuǎn)化異乳糖調(diào)節(jié)基因操縱基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄單元lacZYAPlacI啟動(dòng)子阻遏蛋白lacI（Lacrepressor）第24頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、LacI可以結(jié)合DNA，其結(jié)合位點(diǎn)為operator（O）;作用機(jī)制：LacI結(jié)合O位點(diǎn)，從而抑制RNA聚合酶和LacZYA基因啟動(dòng)子（PLac）的結(jié)合，從而阻止LacZYAmRNA的生成；2、LacI可以結(jié)合誘導(dǎo)物半乳糖，構(gòu)象發(fā)生改變，不能結(jié)合operator,從而對(duì)Lac操縱子的抑制消失。第25頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月阻遏蛋白lacI單體具有DNA結(jié)合域（Helix-turn-helix，1-59位氨基酸）和誘導(dǎo)物結(jié)合域。阻遏蛋白lacI單體寡聚化N’末端C’末端誘導(dǎo)物結(jié)合位點(diǎn)第26頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月阻遏蛋白lacI四聚體的組裝誘導(dǎo)物結(jié)合部位阻遏蛋白lacI由四個(gè)相同的單體亞基組成。第27頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月O1RNApolymerase:a2bb’s70第28頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月TTGACATATAAT-35box-10boxs70的一般識(shí)別位點(diǎn)TTTACATATGTT-35box-10boxLac操縱子promoter:AAAdownup第29頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Lac操縱子的O1回文結(jié)構(gòu)第30頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月InJacobandMonad’smodel,thelacoperoncontainedasingleoperator(O1).However,twoadditionaloperators(O2andO3)weresubsequentlydiscovered.Infact,therearethreeoperators,theclassicaloperatorO1（majoroperator,主操縱基因）,centeredatposition+11,thedownstreamauxiliaryoperator（輔助操縱基因）O2,centeredatposition+412,andupstreamauxiliaryoperatorO3,centeredat–82.CAPisapositiveregulatorofthelacoperon.第31頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四聚體LacI蛋白和DNA的結(jié)合1、四聚體LacI蛋白的兩個(gè)單體通過(guò)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Lac操縱子的O1區(qū)（中心位于+11）緊密結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)為反向重復(fù)序列。2、另一個(gè)二聚體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與O2（中心位于+412bp處）或O3（中心位于-82bp處）疏松結(jié)合，將DNA拉成環(huán)狀。第32頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第33頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月阻遏蛋白lacI與DNA的結(jié)合是通過(guò)異構(gòu)調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)的阻遏蛋白結(jié)合誘導(dǎo)物后構(gòu)型的變化：1、阻遏物由兩個(gè)二聚體組成四聚體；2、二聚體的兩個(gè)DNA結(jié)合域可以同時(shí)插入DNA大溝的兩個(gè)相鄰連續(xù)轉(zhuǎn)角；3、誘導(dǎo)物（異乳糖）結(jié)合，改變了DNA結(jié)合域和核心區(qū)之間的角度方向，使二聚體兩個(gè)頭部不能同時(shí)和DNA結(jié)合，從而降低和操縱基因的親和力第34頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月誘導(dǎo)物改變LacI在DNA上的分布，而不是產(chǎn)生游離阻遏蛋白：隨機(jī)DNA序列和阻遏蛋白也具有親和力，但比操縱基因和阻遏蛋白的親和力低107倍誘導(dǎo)物和阻遏蛋白結(jié)合時(shí)，阻遏蛋白和操縱基因的親和力下降，所有阻遏蛋白結(jié)合在DNA的隨機(jī)序列上（并不形成游離蛋白質(zhì)）除去誘導(dǎo)物后，阻遏蛋白恢復(fù)活性，從隨機(jī)位點(diǎn)直接轉(zhuǎn)移到操縱基因上阻遏蛋白總是與DNA結(jié)合在一起第35頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月問(wèn)題乳糖操縱子即使在阻遏蛋白的阻遏狀態(tài)下，也有本底水平的基因表達(dá)（約為誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)水平的0.1%左右），這是由于LacI與O也偶爾解離，使細(xì)胞中有極低水平的β-半乳糖苷酶及β-半乳糖通透酶生成。第36頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、抑制子LacI——負(fù)調(diào)控2、葡萄糖——抑制Lac操縱子葡萄糖的存在可防止從培養(yǎng)基中吸收其它碳源。當(dāng)葡萄糖和乳糖同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，lac啟動(dòng)子表達(dá)受阻3、CAP-cAMP復(fù)合物——正調(diào)控Lac操縱子的調(diào)控因子第37頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月異乳糖誘導(dǎo)物乳糖重排β-半乳糖苷酶透性酶轉(zhuǎn)乙酰酶

RNA聚合酶LacI單體LacI四聚體lacI介導(dǎo)的lac操縱子基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控機(jī)制第38頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PEP,磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸PEP提供磷酸基團(tuán)，EnzymeI(E1)直接被PEP磷酸化，磷酸化的E1將它的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到HPr（磷酸載體蛋白），磷酸化的HPr是所有酶II（IIAGlc,IIB,IIC,IID）的磷酸基團(tuán)供體：磷酸基團(tuán)從HPr轉(zhuǎn)移到EIIAGlc,再到EIIB,最終到達(dá)連接了葡萄糖的EIIC（有時(shí)會(huì)帶上一個(gè)額外的鏈EIID），使葡萄糖發(fā)生磷酸化。EIIAGlcEIIAGlcIIAGlc是葡萄糖專一的酶II，具有多種調(diào)節(jié)的相互作用。它影響腺苷酸環(huán)化酶、甘油激酶和非PTS通透酶（如：β-半乳糖通透酶）的活性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PhosphotransferaseSystem，PTS）：?jiǎn)翁寝D(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)第39頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月葡萄糖抑制Lac操縱子的分子機(jī)制β-半乳糖通透酶葡萄糖對(duì)Lac操縱子的分解代謝阻遏(catabolicrepression)：IIAGlc由于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)而去磷酸化，導(dǎo)致其結(jié)合β-半乳糖通透酶，從而阻止乳糖進(jìn)入細(xì)胞。第40頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Lac操縱子的正調(diào)控因子功能：感知葡萄糖的缺乏，并通過(guò)激活lac

promoter，使RNA聚合酶結(jié)合并轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因。lacoperon的正調(diào)控因子為一個(gè)復(fù)合體：cAMP結(jié)合其受體（cAMPreceptorprotein,CRP）。CRP又稱為“降解代謝物激活蛋白”（cataboliteactivatorprotein,CAP）環(huán)化AMPcAMP-CAP復(fù)合物正調(diào)控的操縱子：lac,gal,ara等第41頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CAP對(duì)cAMP介導(dǎo)的b-半乳糖苷酶的激活至關(guān)重要

提取wild-type和mutant的細(xì)胞提取物，分別加入不同量的cAMP進(jìn)行體外生產(chǎn)半乳糖苷酶；過(guò)多的cAMP間接抑制了半乳糖苷酶體外表達(dá)的某些步驟第42頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第43頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)錄激活因子CAP

cAMP-CAP與DNA相結(jié)合，造成雙螺旋彎曲，形成一個(gè)“環(huán)狀”結(jié)構(gòu)，lacI無(wú)法與O相結(jié)合，易于形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，只要有這個(gè)“環(huán)”的亞基存在，lac

operon就可以得到表達(dá)。

cAMP-CAP還能直接和RNAPol相互作用，影響RNA聚合酶的活性。第44頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CAP-cAMP-DNAcomplex.Science2002第45頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Cell1994CAP第46頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月cAMP/CAP的調(diào)控活性受ⅡAGlc蛋白的影響：ⅡAGlc蛋白的磷酸化形式可激活腺苷酸環(huán)化酶，當(dāng)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞時(shí)ⅡAGlc蛋白發(fā)生去磷酸化，導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶活性降低。因此，當(dāng)環(huán)境中無(wú)葡萄糖時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP含量升高。腺苷酸環(huán)化酶第47頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月有葡萄糖時(shí)，cAMP濃度降低，lac操縱子表達(dá)下降。由于Plac是弱啟動(dòng)子，只因乳糖的存在而發(fā)生去阻遏而使lac操縱子開(kāi)放表達(dá)水平很低；有cAMP-CAP加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，細(xì)菌才能合成足夠的酶來(lái)利用乳糖。cAMP-CAP對(duì)lac等操縱子具有強(qiáng)的正調(diào)控，能克服操縱子的代謝物阻遏效應(yīng)。第48頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月lac操縱子的強(qiáng)誘導(dǎo)條件：既要有乳糖又要無(wú)葡萄糖葡萄糖（+）；乳糖（-）：不誘導(dǎo)葡萄糖（+）；乳糖（+）：低誘導(dǎo)葡萄糖（-）；乳糖（+）：高誘導(dǎo)第49頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、當(dāng)lacI封閉轉(zhuǎn)錄時(shí)，CAP對(duì)Lac操縱子表達(dá)系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；2、如無(wú)CAP加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，即使沒(méi)有l(wèi)acI與操縱序列結(jié)合，操縱子的轉(zhuǎn)錄活性很低。3、若有葡萄糖或葡萄糖和乳糖共同存在時(shí)，細(xì)菌首先利用葡萄糖。葡萄糖對(duì)Lac操縱子的阻遏作用機(jī)制為分解代謝阻遏。4、

Lac操縱子的誘導(dǎo)作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖。第50頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月“來(lái)得快，去得快”——mRNA合成，對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)迅速第51頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性很強(qiáng)第52頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月操縱子的突變不可誘導(dǎo)型突變（uninduciblemutation）

使操縱子在任何情況下都不能表達(dá)組成型突變（consititutivemutation

）使操縱子不受調(diào)控物的影響而持續(xù)性表達(dá)。第53頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月lacI基因突變導(dǎo)致操縱子持續(xù)性表達(dá)組成型突變突變的lacI基因產(chǎn)物不能結(jié)合DNA第54頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月異乳糖誘導(dǎo)物乳糖重排β-半乳糖苷酶透性酶轉(zhuǎn)乙酰酶

合成誘導(dǎo)物：IPTGRNA聚合酶第55頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一些乳糖類似物不能被β-半乳糖苷酶分解，卻也能與LacI特異性結(jié)合而使其構(gòu)象改變，誘導(dǎo)Lac操縱子的開(kāi)放。如異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)是很強(qiáng)的非代謝性誘導(dǎo)劑，能夠結(jié)合lacI，且性質(zhì)穩(wěn)定，不被細(xì)胞降解；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）也是一種人工合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷酶水解產(chǎn)生藍(lán)色化合物，因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X-gal被廣泛應(yīng)用在分子生物學(xué)和基因工程工作中。第56頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Lac操縱子的應(yīng)用1、藍(lán)白斑篩選2、IPTG體外誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)第57頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

藍(lán)白斑篩選原理：β-半乳糖苷酶可分成2部分即α肽段（N-端的146個(gè)aa）和C-段。α肽段的基因位于載體上并含有多克隆位點(diǎn)，而C-段的基因通過(guò)基因工程技術(shù)插入E.coli基因組。二者在同一菌株中表達(dá)時(shí)，菌株中的C-段與載體上的α肽段互補(bǔ)而具有酶活性，能將無(wú)色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。在MCS上插入新基因?qū)?huì)改變?chǔ)岭亩蔚腛RF而使得載體上的α肽段不能與菌株中的C-段互補(bǔ)而不能切割無(wú)色化合物X-gal，從而產(chǎn)生白斑。選擇轉(zhuǎn)入的陽(yáng)性克隆即選擇白斑。

第58頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月IPTG體外誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)表達(dá)T7RNApolymerase溶原性噬菌體（如：DE3）在感染于寄主細(xì)菌時(shí)，不使細(xì)菌裂解，而成為與細(xì)胞同步增殖的遺傳因子——前噬菌體。前噬菌體通常在寄主細(xì)菌細(xì)胞中的每個(gè)染色體上有1個(gè)，細(xì)菌分裂時(shí)前噬菌體也分裂并分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。

具有前噬菌體的細(xì)菌稱為溶原性細(xì)菌。D第59頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月原核表達(dá)宿主菌的選擇BL21（DE3）：為λDE3溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由lacUV5啟動(dòng)子(不受cAMP-CAP調(diào)控)控制的T7RNA聚合酶基因。pLysS和

pLysE宿主菌帶有編碼T7溶菌酶（為T(mén)7

RNA聚合酶的天然抑制物）的pET相容性質(zhì)粒。帶有pLysS

的細(xì)胞產(chǎn)生少量溶菌酶，而pLysE宿主菌產(chǎn)生更大量酶。這些菌株用于在誘導(dǎo)前抑制T7

RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)，這樣可以穩(wěn)定編碼影響細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的目標(biāo)蛋白的pET重組體。Rosetta（DE3）：Rosetta宿主菌從BL21衍生而來(lái)，可增強(qiáng)帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達(dá)。該菌株通過(guò)一個(gè)相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補(bǔ)充密碼子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。這樣Rosetta菌株提供了“萬(wàn)能”的翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導(dǎo)致的表達(dá)限制。第60頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常用的表達(dá)載體pET系列pGEX系列第61頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第62頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第63頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月阿拉伯糖操縱子（Thearaoperon）：參與阿拉伯糖代謝酶的基因分布于3個(gè)操縱子中：1、araBAD:編碼3個(gè)阿拉伯糖代謝相關(guān)酶，1）核酮糖激酶(ribulokinase)、2）L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinoseisomerase)，3）L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶(L-ribulose-5phosphate-4-epimerase)。2、araE

3、araFGH編碼膜結(jié)合蛋白，參與阿拉伯糖的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)第64頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酮糖激酶L-阿拉伯糖異構(gòu)酶L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶FEMSMicrobiolRev]](2010)1–18第65頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三個(gè)操縱子由一個(gè)調(diào)節(jié)基因（araC）的產(chǎn)物C蛋白調(diào)控：1、araC表達(dá)受到AraC的自我調(diào)控。2、araC既可充當(dāng)阻遏物(不結(jié)合阿拉伯糖)，也可作為激活劑(結(jié)合阿拉伯糖)。3、araC與CAP可充分誘導(dǎo)ara操縱子。4、araC蛋白在阿拉伯糖操縱子上有3個(gè)不同結(jié)合部位:araI、araO1和araO2第66頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月沒(méi)有C蛋白時(shí)，轉(zhuǎn)錄CmRNA，表達(dá)一定水平的C蛋白負(fù)調(diào)控正調(diào)控cAMP-CAP結(jié)合了Ara的C二聚體araBAD和araC的起始轉(zhuǎn)錄需要cAMP-CAP，因此葡萄糖存在時(shí)araBAD和araC操縱子均關(guān)閉。

C蛋白二聚體當(dāng)Ara存在而無(wú)葡萄糖時(shí)，Ara與AraC蛋白結(jié)合使其構(gòu)象改變而釋放araO2，不再成環(huán)，此時(shí)Ara-AraC結(jié)合在araI1，araI2和araO1處。同時(shí)由于cAMP的積累激活CAP，活化的CAP結(jié)合在位于araO1和araI間的CAP位點(diǎn)。araBAD表達(dá)，Ara-araC在araO1處結(jié)合使araC不能表達(dá)。即：araC+Ara和CAP共同作用可激活araBAD轉(zhuǎn)錄當(dāng)cAMP水平較低且缺乏阿拉伯糖時(shí)，AraC二聚體結(jié)合在araO2和araI1半位點(diǎn)使DNA成環(huán)，阻遏araBAD的表達(dá)。第67頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)同時(shí)有葡萄糖和阿拉伯糖時(shí)，低水平的cAMP-CAP不能起始araBAD和araC轉(zhuǎn)錄，因此araBAD和araC都不表達(dá)。第68頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)AraC水平較低時(shí)，其基因從Pc開(kāi)始表達(dá)。當(dāng)AraC蛋白濃度高時(shí)，由于AraC與AraO1結(jié)合，而araO1與AraC基因的啟動(dòng)子重疊，可阻遏araC基因的表達(dá)。

AraC的自我調(diào)控第69頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色氨酸操縱子

(tryptophaneoperon,trpoperon)色氨酸的合成分5步完成。每個(gè)環(huán)節(jié)需要一種酶，編碼這5種酶的基因?yàn)槎囗樂(lè)醋樱磘rpE、trpGD（G和D基因融合）、trpCF（C和F基因融合）

、trpB、trpA。其中，E和G編碼鄰氨基苯甲酸合成酶；D編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；F編碼鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶、A和B編碼色氨酸合成酶；C編碼吲哚甘油-3-磷酶合成酶。色氨酸操縱子負(fù)責(zé)色氨酸的生物合成，當(dāng)培養(yǎng)基中有足夠的色氨酸時(shí)，這個(gè)操縱子自動(dòng)關(guān)閉，缺乏色氨酸時(shí)操縱子被打開(kāi)，trp基因表達(dá)，色氨酸或與其代謝有關(guān)的某種物質(zhì)在阻遏過(guò)程（而不是誘導(dǎo)過(guò)程）中起作用。由于trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖和cAMP-CAP的調(diào)控。

第70頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)

1、trpR和trpABCDE不緊密連鎖，距離很遠(yuǎn)；

2、操縱基因（O）在啟動(dòng)子（P）內(nèi)

3、有弱化子(attenuator)4、啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因不直接相連，二者被前導(dǎo)序列(Leader)所隔開(kāi)第71頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PO第72頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Thetrpoperon的調(diào)控阻遏調(diào)控色氨酸發(fā)揮co-repressor的作用阻遏調(diào)控抑制轉(zhuǎn)錄70倍弱化作用

翻譯影響轉(zhuǎn)錄（只存在原核生物）弱化作用抑制轉(zhuǎn)錄10倍第73頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)色氨酸缺乏時(shí)，調(diào)節(jié)基因（trpR）編碼無(wú)活性的為輔阻遏蛋白aporepressor當(dāng)細(xì)胞中色氨酸濃度較高時(shí)，色氨酸和aporepressor結(jié)合，形成有活性的色氨酸操縱子阻遏蛋白aporepressor阻遏調(diào)控第74頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月高Trp時(shí)：輔阻遏物蛋白+Trp