熒光光譜的原理及應(yīng)用

熒光光譜的原理及其在分子自組裝中的應(yīng)用201311152021/5/91主要內(nèi)容概述熒光光譜法原理熒光的光譜特性我們有關(guān)熒光的工作2021/5/92概述2021/5/932021/5/94基本概念能級(jí):

現(xiàn)代量子物理學(xué)認(rèn)為原子的可能狀態(tài)是不連續(xù)的，因此各狀態(tài)對(duì)應(yīng)能量也是不連續(xù)的。這些能量值就是能級(jí)熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。磷光：從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。分子熒光光譜法(Molecularfluorescencespectroscopy)：又稱為熒光光譜法或熒光分析法．是以物質(zhì)所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與濃度之間的線性關(guān)系為依據(jù)進(jìn)行的定量分析，以熒光光譜的形狀和熒光峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行的定性分析．2021/5/95熒光分析法的特點(diǎn)靈敏度高。檢測(cè)限比吸收光譜法低1-3個(gè)數(shù)量級(jí)；選擇性比吸收光譜法好。因?yàn)槟墚a(chǎn)生紫外可見吸收的分子不一定發(fā)射熒光或磷光；試樣用量少和方法簡(jiǎn)便能提供比吸收光譜多的物理參數(shù)應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣，因?yàn)橛械姆肿硬话l(fā)熒光。2021/5/96熒光光譜法原理2021/5/97發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)吸收光譜與發(fā)射光譜鏡像關(guān)系Stocksshift熒光和磷光的產(chǎn)生2021/5/98熒光的光譜特性2021/5/992021/5/910波長(zhǎng)和強(qiáng)度2021/5/911基本概念激發(fā)波長(zhǎng)：固定熒光的發(fā)射波長(zhǎng)而不斷改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，并記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，所得到的熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的譜圖稱為熒光的激發(fā)光譜。發(fā)射波長(zhǎng)：固定激發(fā)光的波長(zhǎng)而不斷改變熒光的測(cè)定波長(zhǎng)并記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，所得到的熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的譜圖則為熒光的發(fā)射波長(zhǎng)。圖熒光染料C-540A的激發(fā)和發(fā)射光譜2021/5/912基本概念測(cè)試方法：1)判斷激發(fā)波長(zhǎng)：①根據(jù)分子結(jié)構(gòu)判斷；②參照吸收光譜；③三維掃描2)以判斷的波長(zhǎng)為激發(fā)，做發(fā)射掃描，可以得到發(fā)射波長(zhǎng)3)利用得到的發(fā)射波長(zhǎng)，進(jìn)行激發(fā)掃描，即可得到激發(fā)波長(zhǎng)強(qiáng)度：

比爾-朗伯定律If=2.303YfI0εbc應(yīng)用：定性和定量2021/5/913熒光波長(zhǎng)和強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系①躍遷類型（pi->pi*熒光比較強(qiáng)，即有雙鍵的物質(zhì)熒光強(qiáng)）②共軛效應(yīng)（共軛體系是pi電子更容易被激發(fā)，熒光強(qiáng)）③剛性平面結(jié)構(gòu)（有這種結(jié)構(gòu)的分子可以減小分子的振動(dòng)，碰撞失活可能性小，熒光強(qiáng)）④取代基效應(yīng)（給電子基團(tuán)，熒光增強(qiáng)；吸電子基團(tuán)，熒光減弱甚至猝滅）2021/5/914熒光強(qiáng)度與環(huán)境因素的關(guān)系2021/5/915有序介質(zhì)的影響(表面活性劑)CMC2021/5/916熒光量子產(chǎn)率2021/5/917基本概念定義：

熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值.(Y)測(cè)試方法：①參比法Yu=YS·(Fu/Fs)·(As/Au

)·(nu/ns)(A<0.05)；②直接測(cè)量法，要求儀器有積分球注意事項(xiàng)：

溫度，溶劑，激發(fā)波長(zhǎng)，濃度應(yīng)用：量子產(chǎn)率取決于輻射和非輻射躍遷過程，即熒光發(fā)射、系間跨越、外轉(zhuǎn)移和內(nèi)轉(zhuǎn)移等的相對(duì)速率2021/5/918常用物質(zhì)的量子產(chǎn)率Q.Y.StandardsQ.Y.[%]ConditionsforMeasurementExcitation[nm]Cy34PBS540Cy527PBS620CresylViolet53Methol580Fluorescein950.1MNaOH,220C496popop97Cyclohexane300Quininesulfate580.1MH2SO4,220C350Rhodamine101100Ethanol450Rhodamine6G95Water488RhodamineB31Water514Tryptophan13Water,200C280L-Tyrosine14Water2702021/5/919熒光偏振2021/5/920基本概念定義：測(cè)量：

①L-型或者單通道法

②T-型多通道法應(yīng)用：流動(dòng)性,分子基本性質(zhì),酶學(xué)

分子相互作用,熒光偏振免疫,成像常用偏振研究的熒光分子：

1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；羅丹明B；2-苯胺基-6-萘磺酸鈉(2,6-ANS)2021/5/9212021/5/922熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)2021/5/923基本概念定義：

當(dāng)一個(gè)熒光分子（又稱為供體分子，Donor）的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子（又稱為受體分子，Acceptor）的激發(fā)光譜相重疊時(shí)，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。FRET現(xiàn)象的特征:

選擇性激發(fā)供體,卻能檢測(cè)到受體發(fā)射的熒光2021/5/924FRET需要條件供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收光譜必須有顯著的重迭，一般大于30％；供體分子和受體分子間的距離必須在1-10nm之間.D和A間的FRET效率：R0:E=50%時(shí)供體和受體分子間的距離

對(duì)于特定的供體受體對(duì)是常數(shù);R:供體和受體分子間的距離.E:FRET效率.對(duì)于R特別靈敏供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件2021/5/925應(yīng)用檢測(cè)兩個(gè)發(fā)光分子間的重合與共定位檢測(cè)分子間的相互作用檢測(cè)分子的折疊與構(gòu)象變化2021/5/926

供體-受體熒光分子對(duì)BFP-GFP

BFP-YFP

CFP-YFP

CFP-dsRED

GFP-dsRED綠色熒光蛋白類(GreenFluorescentProteins,GFPs)染料類(Dye)FITC-Rhodamine

Alexa488-Cy3

Cy3-Cy52021/5/927熒光壽命2021/5/928基本概念定義：當(dāng)激發(fā)光切斷后熒光強(qiáng)度衰減至原強(qiáng)度的1/e所經(jīng)歷的時(shí)間。它表示了熒光分子的S1激發(fā)態(tài)的平均壽命。測(cè)試方法：①時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC);②相調(diào)制法(PhaseModulationMethods)③頻閃技術(shù)(StrobeTechniques).應(yīng)用：

熒光壽命與物質(zhì)所處微環(huán)境的極性、粘度等條件有關(guān)，因此可以通過熒光壽命直接了解所研究體系發(fā)生的變化。2021/5/929熒光壽命的計(jì)算2021/5/930熒光測(cè)試技術(shù)同步熒光測(cè)定；導(dǎo)數(shù)熒光測(cè)定；三維熒光光譜技術(shù)時(shí)間分辨熒光測(cè)定；相分辨熒光測(cè)定；熒光偏振測(cè)定；熒光免疫測(cè)定；低溫?zé)晒鉁y(cè)定；固體表面熒光測(cè)定；近紅外熒光分析法；熒光反應(yīng)速率法熒光顯微與成像技術(shù)；空間分辨熒光技術(shù)熒光探針技術(shù)；單分子熒光檢測(cè)技術(shù)；熒光光纖化學(xué)傳感器2021/5/931常用熒光探針探針Ex(nm)Em(nm)探針Ex(nm)Em(nm)1,8-ANS372480Cy3550570Hydroxycoumarin325386Hoechst33342343483Aminocoumarin350445EthidiumBromide493620NBD466536Fluo-3(膜穿透性)506526Fluorescein495519DPH362432RhodamineB570590EGFP488507AlexaFluro350343442Calcein4965172021/5/932我們有關(guān)熒光的工作2021/5/933熒光穩(wěn)態(tài)模塊磷光模塊顯微熒光模塊系統(tǒng)總圖熒光壽命模塊2021/5/934圖

熒光分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)2021/5/935兩親性超支化聚合物分子自組裝HBPO-star-PEO2021/5/936熒光光譜法研究?jī)?nèi)容聚合物CMC的測(cè)定熒光猝滅法測(cè)量分子的分布能量共振轉(zhuǎn)移制備熒光呼吸囊泡熒光偏振測(cè)量分子的流動(dòng)性熒光壽命研究體系微環(huán)境發(fā)光聚合物熒光性能的測(cè)定2021/5/937聚合物CMC的測(cè)定芘不溶于水，溶于乙醇、乙醚、甲苯、四氫呋喃等有機(jī)溶劑。隨著溶劑的極性增加，I1/I3降低，因而可以用于聚合物組裝的研究JournalofPolymerScience,PartA:PolymerChemistry48(20),pp.4428-44382021/5/938能量共振轉(zhuǎn)移制備熒光呼吸囊泡B)SchematicrepresentationoftheprotonationanddeprotonationofPEG-b-PDMA-AzointheC)Steady-statefluorescencespectraofthevesicularsolutionatpHvaluesbetween4and12D)ReversiblepH-inducedchangeinthefluorescenceuponthealternateadditionofHClandNaOH2021/5/939發(fā)光聚合物熒光性能的測(cè)定2021/5/940參考書目JonathanD.Violin,etal.,AgeneticallyencodedfluorescentreporterrevealsoscillatoryphosphorylationbyproteinkinaseC.JCellBiology,2003,161:899–909ElizabethAJetl.,FRETImaging.NatureBiotechnology,2003,21:13887-1395RajeshBS.Fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopyimagingoflivecellproteinlocalizations.JCellBiology,2003,160:629–633JinZhang,etal.,.GeneticallyencodedreportersofproteinkinaseAactivityrevealimpactofsubstratetethering.PNAS,2001,98:14997–15002MichaelG.Erickson,etal.,DsRedasaPotentialFRETPartnerwithCFPandGFP.BiophysicalJournal,200