基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座

基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第1頁(yè)人類(lèi)疾病原因內(nèi)因：基因結(jié)構(gòu)改變（基因突變）——點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因擴(kuò)增

基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性

基因表示異常外因：

病原體侵入基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第2頁(yè)對(duì)于疾病診療依據(jù)：臨床表現(xiàn)試驗(yàn)室診療技術(shù)：細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)生物化學(xué)代謝產(chǎn)物和酶活性改變檢驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)

基因診療基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第3頁(yè)一、基因診療概述(一)基因診療概念與特點(diǎn)(二)基因診療基礎(chǔ)原理與臨床意義基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第4頁(yè)(一)基因診療概念與特點(diǎn)1．概念：指利用分子生物學(xué)技術(shù)，從DNA或RNA水平檢測(cè)基因存在、分析基因結(jié)構(gòu)變異和表示狀態(tài)，對(duì)疾病作出診療方法和過(guò)程?；蛟\療以DNA和RNA為診療材料，

DNA診療RNA診療基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第5頁(yè)2．基因診療特點(diǎn)：（1）直接檢測(cè)基因，屬病因診療，針對(duì)性強(qiáng)；（2）特異性強(qiáng)、靈敏度高：因?yàn)榛蛟\療采取核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)；（3）適用范圍廣：其應(yīng)用范圍已從原先局限遺傳性疾病擴(kuò)充到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域。基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第6頁(yè)基因診療評(píng)價(jià)特異性靈敏度重復(fù)性快速經(jīng)濟(jì)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第7頁(yè)(二)基因診療基礎(chǔ)原理與臨床意義1．基礎(chǔ)原理：

經(jīng)過(guò)檢測(cè)致病基因（包含內(nèi)源基因與外源基因）存在、量多少，結(jié)構(gòu)改變是否及表示水平是否正常，以確定被檢驗(yàn)者是否存在基因水平異常改變，以此作為疾病確診依據(jù)。2．臨床意義:

對(duì)有表型出現(xiàn)疾病作出明確診療

早期快速診療

確定個(gè)體對(duì)疾病易感性疾病分期分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等

基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第8頁(yè)二、基因診療常見(jiàn)技術(shù)與方法(一)基因診療常見(jiàn)技術(shù)(二)基因診療基礎(chǔ)方法基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第9頁(yè)(一)基因診療常見(jiàn)技術(shù)核酸分子雜交PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）限制性酶切分析SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）DNA測(cè)序DNA芯片技術(shù)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第10頁(yè)基因診療技術(shù)分類(lèi)1、Molecularhybridization：

Southern,Northern,dotblot,2、PCR3、DNA測(cè)序4、DNA芯片技術(shù)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第11頁(yè)1.核酸分子雜交

MolecularhybridizationSouthernblot——DNANorthernblot——RNADotblot，InSituHybridization,基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第12頁(yè)核酸雜交基礎(chǔ)原理：利用核酸變性和復(fù)性理論：（1）雙鏈DNA分子在一些理化原因作用下解旋，條件恢復(fù)后又可恢復(fù)其雙螺旋結(jié)構(gòu)；（2）含有互補(bǔ)堿基序列異源核酸單鏈之間一樣可按堿基互補(bǔ)配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過(guò)氫鍵結(jié)合為雙鏈?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第13頁(yè)核酸分子雜交流程示意圖待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未參加雜交探針檢測(cè)雜交信號(hào)制備探針核酸片段探針標(biāo)記加入標(biāo)識(shí)核酸探針基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第14頁(yè)探針?lè)N類(lèi)DNA

探針:基因組DNA探針;基因探針cDNA探針:當(dāng)前應(yīng)用最廣泛寡核苷酸探針(Oligonucleotideprobes)RNA探針:基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第15頁(yè)

不一樣探針在應(yīng)用中有各自特點(diǎn),但最主要是探針序列選擇.而探針序列又是依據(jù)待測(cè)核酸序列選擇。對(duì)致病性微生物應(yīng)選取其最保守、最特異序列；對(duì)突變基因檢測(cè)，應(yīng)用含有突變位點(diǎn)序列或待測(cè)基因編碼ｍＲＮＡ序列?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第16頁(yè)探針標(biāo)識(shí)物放射性標(biāo)識(shí)物32P，35S，125I，3H非放射性標(biāo)識(shí)物生物素，地高辛，熒光素，酶，金屬基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第17頁(yè)SouthernblotNNTTNTT基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第18頁(yè)1、Southernblot：用于DNA檢測(cè)，不但能檢測(cè)出特異DNA片段，還能進(jìn)行定位和測(cè)定分子量，可用于基因限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析、基因突變分析等。2、Northernblot：雜交用于RNA檢測(cè)，能對(duì)組織細(xì)胞中總RNA或mRNA進(jìn)行定性和定量分析。3、dotblot：既可檢測(cè)DNA也或檢測(cè)RNA，用于基因組中特定基因及其表示定性和定量分析。缺點(diǎn)：特異性較低，不能判定所分析基因分子量。4、原位雜交：在組織、細(xì)胞和染色體水平作核酸定性和定量分析，并可定位。基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第19頁(yè)P(yáng)CR是在試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行同一段DNA片段合成過(guò)程（二）PCR技術(shù)是基因診療一個(gè)基礎(chǔ)技術(shù)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第20頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡(jiǎn)單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率基因擴(kuò)增技術(shù)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第21頁(yè)1、直接采取PCR技術(shù)進(jìn)行基因診療

經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性基因，能夠確定病原生物基因是否存在或分析疾病相關(guān)體內(nèi)基因缺失或基因突變

基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第22頁(yè)2、采取PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR－RFLP）基因突變?cè)斐苫驂A基組成和次序發(fā)生改變，會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)或使原有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)消失。所以，突變基因經(jīng)對(duì)應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶水解后，其電泳條帶數(shù)量和大小就會(huì)發(fā)生改變，依據(jù)這些改變能夠判斷突變是否存在。即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)。

PCR－RFLP就是利用PCR技術(shù)先將包含待測(cè)位點(diǎn)DNA片段擴(kuò)增出來(lái)，然后用識(shí)別該位點(diǎn)限制性?xún)?nèi)切酶水解，依據(jù)限制性片段數(shù)量和長(zhǎng)度作出診療?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第23頁(yè)3、采取PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù)等位基因特異性寡核苷酸探針技術(shù)（ASO）原理：針對(duì)已知突變位點(diǎn)基因，能夠分別針對(duì)已知突變位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸探針，其中一條為野生型探針，與無(wú)突變序列互補(bǔ)，另一個(gè)為突變型探針，與突變序列互補(bǔ)。同時(shí)設(shè)計(jì)探針時(shí)，突變堿基應(yīng)位于探針中央，這么在嚴(yán)格控制雜交和洗脫條件下，只有完全互補(bǔ)探針保留下來(lái)，形成穩(wěn)定雜交分子，而中央堿基與靶序列不匹配探針則被洗脫?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第24頁(yè)

PCR/ASO則是采取PCR擴(kuò)增受檢者基因目標(biāo)片段，并與對(duì)應(yīng)ASO探針雜交，假如受檢者DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與正常探針雜交，而不與突變探針雜交，表示受檢者不存在突變基因；假如只有突變探針能夠雜交，說(shuō)明突變基因?yàn)榧兒献?；假如二者都存在，則說(shuō)明突變基因?yàn)殡s合子。采取PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第25頁(yè)

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常探針

突變探針基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第26頁(yè)4、PCR產(chǎn)物反相點(diǎn)雜交分析技術(shù)

此項(xiàng)技術(shù)與PCR/ASO技術(shù)原理完全相同，只是雜交時(shí)采取是反相雜交。是將探針固定在膜上成為固定相，用PCR產(chǎn)物作為液體相，進(jìn)行雜交試驗(yàn)?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第27頁(yè)

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析是一個(gè)基于單鏈DNA構(gòu)象差異來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變方法。DNA經(jīng)變性形成單鏈后，在中性條件下單鏈DNA會(huì)因其分子內(nèi)堿基之間相互作用，形成一定立體構(gòu)象。相同長(zhǎng)度單鏈DNA會(huì)因分子內(nèi)堿基組成或排列次序不一樣，形成構(gòu)象就不一樣，這么就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。對(duì)長(zhǎng)度相同而構(gòu)象不一樣單鏈DNA在非變性聚丙烯胺凝膠電泳中表現(xiàn)出不一樣遷移率。

5、采取PCR產(chǎn)物單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析進(jìn)行基因診療基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第28頁(yè)

PCR-SSCP技術(shù)就是利用PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片段，經(jīng)過(guò)變性成為單鏈，然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個(gè)核苷酸改變會(huì)造成DNA片段構(gòu)象改變，其遷移率也會(huì)改變，從而檢測(cè)基因突變?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第29頁(yè)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第30頁(yè)

該技術(shù)是先制備濃度從低到高變性劑凝膠，然后將待測(cè)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，到DNA電泳到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性位置時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)，因?yàn)椴灰粯覦NA片段堿基組成不一樣，所以在凝膠中泳動(dòng)發(fā)生變性位置不一樣，遷移率也不一樣，所以能夠?qū)⑾嗤L(zhǎng)度但堿基組成不一樣DNA片段分開(kāi)，從而能檢測(cè)出基因突變。6、采取PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳技術(shù)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第31頁(yè)

DNA甲基化是表觀(guān)遺傳學(xué)主要組成個(gè)別，在維持正常細(xì)胞功效、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類(lèi)腫瘤發(fā)生中起著主要作用，是當(dāng)前新研究熱點(diǎn)之一。如在普通正常細(xì)胞中，基因調(diào)控區(qū)CPG島處于非甲基化狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，這些區(qū)域往往展現(xiàn)甲基化狀態(tài)。所以DNA甲基化研究是一熱點(diǎn)。7、甲基化特異性PCR技術(shù)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第32頁(yè)

將DNA先用亞硫酸鹽處理，這么未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化不變，隨即行引物特異性PCR。在MS-PCR中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)為甲基化特異性引物（primerⅠ），一對(duì)為非甲基化引物（primerⅡ），進(jìn)行特異性擴(kuò)增，只有結(jié)合完全甲基化或非甲基化特異性引物片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物，最終能夠確定研究DNA片段部位甲基化情況。甲基化特異性PCR技術(shù)（MS-PCR）基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第33頁(yè)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第34頁(yè)以上介紹基于PCR擴(kuò)增技術(shù)建立基因診療技術(shù)，只能提供定性結(jié)果，即有沒(méi)有突變。但對(duì)基因表示異常疾病，上述方法無(wú)法滿(mǎn)足需要，還需要研究其基因表示量上改變分析，故還可利用PCR定量分析基因表示。PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀釋法、極限稀釋法、非競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)照法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法、

熒光定量PCR8、采取PCR技術(shù)進(jìn)行靶核酸定量分析基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第35頁(yè)P(yáng)CR擴(kuò)增有限性-平臺(tái)期及平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）

PCR擴(kuò)增平臺(tái)效應(yīng)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第36頁(yè)梯度（系列）稀釋法：在擴(kuò)增檢測(cè)待測(cè)樣本同時(shí)，擴(kuò)增一系列稀釋已知標(biāo)準(zhǔn)（通常為質(zhì)粒DNA）假如在該標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物/模板成線(xiàn)性相關(guān)，則可推導(dǎo)出同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)樣本中PCR模板相對(duì)量.必須在擴(kuò)增指數(shù)期進(jìn)行優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，可作粗糙定量分析。缺點(diǎn)：不準(zhǔn)確，影響原因多。

基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第37頁(yè)首先將原始模板進(jìn)行梯度稀釋;然后對(duì)該稀釋系列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)定;最低陽(yáng)性樣本被認(rèn)為含有與一已知標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列中最終陽(yáng)性樣本中相同量PCR模板基礎(chǔ)依據(jù)：PCR擴(kuò)增有效起始模板分子數(shù)為104～106個(gè)改良方法：極限稀釋分析基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第38頁(yè)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第39頁(yè)非競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)照基因定量法該定量法是靶基因與參考基因同時(shí)擴(kuò)增。即在一樣反應(yīng)條件下，在一個(gè)試管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增來(lái)自同一DNA一段靶序列和另一段內(nèi)標(biāo)序列(通常是管家基因或它們mRNA)。經(jīng)過(guò)比較兩種序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶顏色強(qiáng)度對(duì)靶基因定量?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第40頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)PCR與前述方法相同，即靶基因與參考標(biāo)準(zhǔn)在同一反應(yīng)管中共同擴(kuò)增，但參考標(biāo)準(zhǔn)通常是一段人工合成模板而不是內(nèi)源性基因。競(jìng)爭(zhēng)PCR必須構(gòu)建一個(gè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，此標(biāo)準(zhǔn)能與靶基因競(jìng)爭(zhēng)聚合酶、核苷酸和引物分子，含有相同引物結(jié)合位點(diǎn)，其擴(kuò)增產(chǎn)物能經(jīng)過(guò)電泳或高效液相色譜(HPLC)等方法區(qū)分開(kāi)來(lái)。將競(jìng)爭(zhēng)模板作系列稀釋后，加入到恒量樣品DNA進(jìn)行PCR，經(jīng)過(guò)分離和分析競(jìng)爭(zhēng)模板與樣品DNA產(chǎn)量，對(duì)樣品DNA進(jìn)行定量分析。競(jìng)爭(zhēng)性PCR：基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第41頁(yè)3.DNA

sequencingDNA序列測(cè)定是最直接、最準(zhǔn)確基因診療技術(shù)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第42頁(yè)例：四色熒光自動(dòng)測(cè)序分析結(jié)果基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第43頁(yè)基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第44頁(yè)4.DNA芯片技術(shù)

DNAchipsormicroarray基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第45頁(yè)

指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量探針以顯微打印方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)識(shí)樣品雜交，經(jīng)過(guò)對(duì)雜交檢測(cè)分析，得出樣品遺傳信息（基因序列及表示信息）

因?yàn)樵谥苽溥^(guò)程中利用了計(jì)算機(jī)芯片制備技術(shù)如顯微光蝕刻、顯微打印等，且常見(jiàn)硅芯片作為固相支持物，所以稱(chēng)為DNA芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)概念基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第46頁(yè)DNA芯片技術(shù)原理大規(guī)模集成固相雜交基礎(chǔ)原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)、變性和復(fù)性原理

以大量已知序列寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測(cè)樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后經(jīng)過(guò)定性、定量分析得出待測(cè)樣品基因序列及表示信息基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第47頁(yè)第二節(jié)對(duì)不一樣疾病采取不一樣基因診療策略

人類(lèi)疾病各種多樣，致病原因不一樣，所以在基因診療上也有不一樣路徑和策略。1、對(duì)致病基因已經(jīng)找到、發(fā)生機(jī)制清楚疾病，能夠經(jīng)過(guò)直接檢測(cè)致病基因進(jìn)行基因診療。如：病原微生物感染：病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌等，及與疾病相關(guān)機(jī)體內(nèi)源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。

基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第48頁(yè)2、對(duì)致病基因還沒(méi)找到，發(fā)生機(jī)制也沒(méi)有完全清楚，但致病基因已定位于染色體或基因組特定區(qū)域疾病，能夠經(jīng)過(guò)檢測(cè)致病基因聯(lián)鎖遺傳標(biāo)識(shí)進(jìn)行基因診療。

如：用限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)識(shí)，利用該遺傳標(biāo)識(shí)與相鄰基因在遺傳過(guò)程中分離幾率很低，經(jīng)常一起遺傳，形成連鎖特點(diǎn)，建立了染色體基因連鎖圖，依據(jù)基因連鎖圖，經(jīng)過(guò)分析連鎖基因遺傳標(biāo)識(shí)，可判斷致病基因存在可能性。第二節(jié)對(duì)不一樣疾病采取不一樣基因診療策略基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第49頁(yè)3、對(duì)多原因、多基因疾病，能夠經(jīng)過(guò)檢測(cè)表型克隆基因進(jìn)行基因診療。第二節(jié)對(duì)不一樣疾病采取不一樣基因診療策略如高血壓、冠心病、腫瘤、精神病、本身免疫性疾病，因?yàn)榧膊“l(fā)生原因復(fù)雜，包括多基因、多原因。所以可采取表型克隆方法來(lái)分析診療。原理：從分析正常和異?；蚪M采取差異顯示等技術(shù)找到正常人和疾病患者之間差異序列，進(jìn)行克隆。依據(jù)克隆一組基因差異序列制作對(duì)應(yīng)探針，用制備這一組探針檢測(cè)相關(guān)疾病方法?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第50頁(yè)第二節(jié)對(duì)不一樣疾病采取不一樣基因診療策略4、對(duì)一些因基因表示異常出現(xiàn)疾病，可經(jīng)過(guò)基因表示定量分析進(jìn)行基因診療。對(duì)與基因表示異常出現(xiàn)疾病，能夠在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)該基因表示mRNA量進(jìn)行分析，作出診療。基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第51頁(yè)第三節(jié)基因診療應(yīng)用前景1.雜交基礎(chǔ)上RFLP分析（20世紀(jì)80年代）2.PCR及其衍生技術(shù)3.基因芯片技術(shù)基因診療發(fā)展歷史基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第52頁(yè)第三節(jié)基因診療應(yīng)用前景1.理論2.技術(shù)3.倫理基因診療過(guò)程中存在問(wèn)題基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第53頁(yè)

遺傳病基因診療是在基因水平上對(duì)核酸堿基序列突變檢測(cè)，從遺傳物質(zhì)分子水平上揭示疾病發(fā)生原因和分子機(jī)制。遺傳病診療分為產(chǎn)前檢驗(yàn)、癥狀前診療和癥狀后診療。遺傳病基因診療是進(jìn)行產(chǎn)前檢驗(yàn)和癥狀前診療唯一選擇，也是遺傳病預(yù)防最為有效伎倆。第四節(jié)、基因診療技術(shù)檢測(cè)遺傳病基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第54頁(yè)基因診療技術(shù)路徑：①直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表示是否異常直接診療路徑；②利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析間接診療路徑。第四節(jié)遺傳病基因診療基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第55頁(yè)第四節(jié)遺傳病基因診療直接診療：檢測(cè)已知致病基因

必要條件①被檢基因突變類(lèi)型與疾病發(fā)病有直接因果關(guān)系：②被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定；③被檢基因突變位點(diǎn)固定而且已知?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第56頁(yè)

1.點(diǎn)突變：（1）造成特異性限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)改變

直接診療：檢測(cè)已知致病基因基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第57頁(yè)血紅蛋白病能夠由血紅蛋白結(jié)構(gòu)或合成異常所致遺傳性疾病。前者稱(chēng)為異常血紅蛋白病，后者稱(chēng)為地中海貧血。針對(duì)異常血紅蛋白病如鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥是因?yàn)橹榈鞍谆虻?位密碼子GAG突變成GTG，造成蛋白結(jié)構(gòu)異常。對(duì)此遺傳病基因診療可采取PCR-限制性?xún)?nèi)切酶分析技術(shù)。鐮狀紅細(xì)胞貧血HBS-Beta株蛋白基因突變：基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第58頁(yè)×5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組限制性酶切分析PCR-RE分析MstIICCTGAGG-CCTGTGG基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第59頁(yè)+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組限制性酶切分析基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第60頁(yè)1.點(diǎn)突變：（2）無(wú)限制性酶切位點(diǎn)改變

直接診療：檢測(cè)已知致病基因

PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交等技術(shù)。PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)可快速、簡(jiǎn)易地檢測(cè)已知突變。

基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第61頁(yè)Β地中海性貧血基因診療（PCR-ASO）已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡和苷酸探針，32P標(biāo)識(shí)，進(jìn)行SouthernBlot雜交/斑點(diǎn)雜交。

NormalβΑGeneProbe——與正常βΑ雜交MutationβSGeneProbe——與異常βS雜交基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第62頁(yè)

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常探針

突變探針基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第63頁(yè)1、Gene缺失遺傳病診療1）α地貧Gene診療α基因不一樣程度缺失引發(fā)不一樣類(lèi)型α地貧，α基因缺失1～4個(gè)。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb片段，而缺失一個(gè)αGene時(shí)可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第64頁(yè)以αGene為探針，Southernblot方法檢測(cè)αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第65頁(yè)直接診療：檢測(cè)已知致病基因

在DNA序列上有較長(zhǎng)一段序列重新排布。包含大片段（數(shù)十個(gè)堿基甚至數(shù)千個(gè)堿基）丟失、插入、取代、復(fù)制放大和倒位等，這些突變進(jìn)而引發(fā)更大范圍內(nèi)染色體結(jié)構(gòu)上改變從而影響多個(gè)基因功效，即染色體突變或畸變，包含染色體易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等2.基因重排\缺失：核酸分子探針雜交與PCR基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第66頁(yè)

（1）Southern印跡雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)一系列對(duì)應(yīng)于缺失區(qū)域核苷酸探針，正常者出現(xiàn)雜交信號(hào)，而患者則因缺失這一區(qū)域，而檢測(cè)不到雜交信號(hào)（2）多重PCR，1988年Chamberlain等采取多重PCR技術(shù)成功地同時(shí)擴(kuò)增了人類(lèi)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因多個(gè)基因座

直接診療：檢測(cè)已知致病基因基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第67頁(yè)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因診療DMD是一個(gè)嚴(yán)重致死性疾?。╔R），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進(jìn)行性萎縮和乏力。病因是抗肌萎縮蛋白基因突變所致。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79個(gè)Exon，cDNA全長(zhǎng)13974bp，編碼3685Aa，分子量427kD。DMD最主要遺傳缺點(diǎn)是外顯子缺失，約占60%~70%?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第68頁(yè)1.DNAMarker2.陽(yáng)性對(duì)照3.孕婦

1.DNAMarker2.陽(yáng)性對(duì)照3.孕婦4.胎兒

5.陰性對(duì)照

4.胎兒

5.陰性對(duì)照采取多重PCR法擴(kuò)增該基因多個(gè)外顯子基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第69頁(yè)3.基因表示異常mRNA相對(duì)定量分析mRNA長(zhǎng)度分析直接診療：檢測(cè)已知致病基因基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第70頁(yè)二、遺傳病間接診療當(dāng)致病基因即使已知，但其異常性質(zhì)未知時(shí)，或疾病Gene本身還未知時(shí)，主要經(jīng)過(guò)Gene和遺傳標(biāo)識(shí)連鎖分析間接地作出診療。連鎖分析基于遺傳標(biāo)識(shí)與Gene在染色體上連鎖，經(jīng)過(guò)對(duì)受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，分析子代取得某種遺傳標(biāo)識(shí)與疾病關(guān)系，間接推斷受檢子代是否取得帶有致病基因染色體，間接地判斷并做出診療。遺傳標(biāo)識(shí)（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、微衛(wèi)星DNA序列、單核苷酸多態(tài)性等）基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第71頁(yè)1Southernblot--RFLP診療(PKU)

PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點(diǎn),用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系組員外周血DNA雜交。間接基因診療基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第72頁(yè)患者為19kb片段純合子,說(shuō)明患者缺點(diǎn)PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺點(diǎn)PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb和19kb片段雜合子，為表型正常致病基因攜帶者。間接基因診療基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第73頁(yè)成年型多囊腎病基因診療例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終造成腎功效衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13.3，但致病基因還未克隆，基因產(chǎn)物生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也還未說(shuō)明，但已證實(shí)APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，所以，能夠經(jīng)過(guò)RFLP連鎖分析進(jìn)行診療?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第74頁(yè)以3`HVR為探針，與PvuII酶切后家系相關(guān)組員基因組DNA進(jìn)行SouthernBlot

基因組DNAPvuII酶切DNA片段變性轉(zhuǎn)膜探針變性雜交結(jié)果分析間接基因診療基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第75頁(yè)結(jié)果1212345

5．7kb3．4kb2．3kb

基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第76頁(yè)結(jié)果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,說(shuō)明致病基因與3.4kb片段連鎖,并按孟德?tīng)柗绞竭z傳.II5不含3.4kb片段,產(chǎn)前診療正常.基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第77頁(yè)遺傳疾病基因診療方法基因異常方法探針、引物或限制酶基因組DNA印跡雜交缺失基因探針基因缺失PCR擴(kuò)增引物包含缺失或在缺失部位內(nèi)

RFLP分析突變?cè)斐善淝悬c(diǎn)消失限制酶點(diǎn)突變ASO雜交正常和異常ASO探針PCR產(chǎn)物多態(tài)性分析（SSCP）引引物包含突變部位基因未知與疾病連鎖多態(tài)性分析與疾病連鎖多態(tài)位點(diǎn)探針或引物基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第78頁(yè)腫瘤基因診療腫瘤發(fā)生包括多個(gè)基因、各種原因；發(fā)生過(guò)程呈多階段性，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，同時(shí)不一樣腫瘤發(fā)生機(jī)制也不相同，所以在腫瘤基因診療時(shí)，無(wú)法采取統(tǒng)一策略?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第79頁(yè)策略一、經(jīng)過(guò)檢測(cè)腫瘤染色體異位及融合基因診療淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中,染色體異位和重排發(fā)生較為普遍.臨床上出現(xiàn)炎癥性淋巴結(jié)腫大與淋巴瘤腫大判定:在淋巴瘤細(xì)胞中，T細(xì)胞受體（TCR）基因和IgH基因發(fā)生重排，原來(lái)相隔數(shù)百個(gè)堿基IgH基因和TCR基因V區(qū)和J區(qū)基因就會(huì)靠近在一起，而炎癥增生性細(xì)胞內(nèi)就不會(huì)發(fā)生基因重排，故經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增能夠判定之?；蛟\斷專(zhuān)題知識(shí)講座第80頁(yè)策略二、經(jīng)過(guò)檢測(cè)癌基因和抑癌基因診療腫瘤癌基因激活及抑癌基因失活與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系親密。多數(shù)腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中都檢測(cè)到癌基因與抑癌基因突變。用基因診療方法：定量PCR、印跡技術(shù)、PCR-SSCP等檢測(cè)。如ras癌基因，其激活分子機(jī)制主要是點(diǎn)突變，所以可經(jīng)過(guò)PCR-ASO、PCR-SSCP等方法。

P53基因是抑癌基因，在腫瘤組織中其常發(fā)生突變而失活。所以可經(jīng)過(guò)PCR-SSCP、DNA測(cè)序分析等，可檢測(cè)P53基因突變。基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第81頁(yè)策略三、經(jīng)過(guò)檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒診療腫瘤鼻咽癌Burkitt淋巴瘤肝癌宮頸癌EB病毒HBV、HCV人類(lèi)乳頭瘤病毒HPV基因診斷專(zhuān)題知識(shí)講座第82頁(yè)策略四、檢測(cè)腫