核酸的提取分離

核酸的提取分離核酸的提取分離第1頁第五章核酸提取分離§5.1概述§5.2核酸理化性質(zhì)§5.3核酸作用與用途§5.4動(dòng)物臟器核酸提取分離方法§5.5轉(zhuǎn)移因子制備§5.6輔酶A提取§5.7復(fù)合輔酶提取§5.8從啤酒酵母中提取RNA核酸的提取分離第2頁§5.1概述核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)

戊糖(pentose)堿基(base)核酸的提取分離第3頁組成核苷酸堿基核酸的提取分離第4頁Fig.2-4TheprimarystructureofDNA.核酸的提取分離第5頁脫氧核糖核酸（DNA）主要存在于細(xì)胞核染色體中，核糖核酸（RNA）主要存在于細(xì)胞微粒體中，各種生物體含有核酸多少不一樣應(yīng)用于臨床核酸及其衍生物類生化產(chǎn)品越來越多我國(guó)人工合成丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸，76個(gè)核苷酸，與天然酵母丙氨酸核糖核酸含有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)，有接收丙氨酸、將攜帶丙氨酸摻入到蛋白質(zhì)中生物活力核酸的提取分離第6頁呈味核苷酸是當(dāng)前國(guó)際上流行新型鮮味劑，其學(xué)名為5－IMP（肌苷酸鈉）、5－GMP（鳥苷酸鈉）、I＋G（50％IMP＋50GMP），我國(guó)第三代鮮味劑雞精特點(diǎn)為：由雞肉、雞蛋、呈味核苷酸、水解蛋白粉、味精及各種調(diào)味料復(fù)合而成。核酸類藥品主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶類相關(guān)衍生物保健品：某核酸企業(yè)宣稱其產(chǎn)品含有增強(qiáng)基因自主修復(fù)能力，還能改進(jìn)微循環(huán)、改進(jìn)腦機(jī)能；促進(jìn)新陳代謝、抗疲勞；提升免疫力；活化皮膚細(xì)胞、潤(rùn)膚美容。

核酸在食品和藥品領(lǐng)域中應(yīng)用？核酸的提取分離第7頁核酸工業(yè)市場(chǎng)分析核酸藥品產(chǎn)品開發(fā)已經(jīng)有近70年歷史。當(dāng)前，日本是核酸產(chǎn)品最大生產(chǎn)國(guó)，其年產(chǎn)量約7500噸，約占世界產(chǎn)量90%；西方國(guó)家中，意大利也有核酸產(chǎn)品，但產(chǎn)量不是很大。多年來，韓國(guó)核酸產(chǎn)業(yè)興起，主要為調(diào)味品。我國(guó)核酸產(chǎn)品研究開發(fā)起步較早，并取得了令人矚目標(biāo)成就。然而當(dāng)前我國(guó)核酸藥品產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口，僅ATP一項(xiàng)每年就從日本進(jìn)口金額達(dá)八千萬美元核酸的提取分離第8頁§5.2核酸理化性質(zhì)§5.2.1核酸普通性質(zhì)1、DNA分子與蛋白質(zhì)分子、RNA相對(duì)分子質(zhì)量？2、DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末，均微溶于水，稀堿溶液中成鹽后易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，但可溶于乙醇水溶液，乙醇＞50％（w/w）時(shí)，DNA析出，當(dāng)＞75％時(shí)，RNA也沉淀出來→溶解度差異分離≥106幾千到百萬幾萬到幾百萬核酸的提取分離第9頁鹽溶液中溶解度差異提取RNA時(shí)NaCl鹽溶液濃度僅為0.14mol/L即可而提取DNA時(shí)，需先用0.14mol/LNaCl將RNA除掉，再繼續(xù)增加NaCl濃度至1mol/L時(shí)才能夠?qū)NA提取出來核酸的提取分離第10頁§5.2.1核酸普通性質(zhì)3、DNA極稀溶液黏度極大，變性時(shí)黏度降低，pH超出5.6-10.9時(shí)，相對(duì)黏度突然降低4、可被酸、堿或酶水解成各種組分，用層析、電泳等方法分離，主要利用：

RNA磷酸酯鍵對(duì)堿敏感：室溫，0.3~1mol/LKOH，24h，可將RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸混合物。★DNA抗堿水解★生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA信使，完成任務(wù)后快速降解。核酸的提取分離第11頁§5.2.2核酸紫外吸收性質(zhì)嘌呤、嘧啶環(huán)→共軛雙鍵→紫外吸收，核酸λmax260nm附近，而λmin230nm1、判定純度純DNAA260/A280≥1.8；純RNAA260/A280≥2.0若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280↓2、含量計(jì)算，吸光值為1.00時(shí)，相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸核酸的提取分離第12頁DNA和RNA均在紫外光下有最高吸收峰，可采取OD260nm測(cè)定其濃度另首先DNA和RNA含磷含糖，所以可經(jīng)過糖含量及磷含量測(cè)定方法間接表征核酸含量RNA所含糖為核糖→苔黑酚法測(cè)定；DNA所含糖為脫氧核糖→二苯胺法測(cè)定。含磷量測(cè)定時(shí)均需先經(jīng)過消化將有機(jī)磷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)磷才能測(cè)定，純RNA含磷量為9％，而純DNA含磷量為9.2%。核酸的提取分離第13頁§5.2.3核酸變性和復(fù)性

高溫（熱變性）、酸堿（pH小于4或大于11）及一些變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）能破壞核酸雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，變成單鏈，不包括共價(jià)鍵斷裂。核酸的提取分離第14頁變性后理化性質(zhì)★DNA變性是暴發(fā)式，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄溫度范圍內(nèi)。粘度降低，浮力密度升高。二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，個(gè)別失活。260nm吸收值升高?！?/p>

增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)：在DNA變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)：在DNA復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。核酸的提取分離第15頁熔解溫度（Tm）：★DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去二分之一時(shí)對(duì)應(yīng)溫度。濃度50ug/mL時(shí)，雙鏈DNAA260=1.00；完全變性（單鏈）A260=1.37

當(dāng)A260增加到最大增大值二分之一時(shí)，即1.185時(shí)，對(duì)應(yīng)溫度即為Tm。

DNATm普通在82—95℃之間核酸的提取分離第16頁影響DNATm值原因1、DNA均一性：均一性高，變性溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA均一性。2、G-C含量與Tm值成正比（why？）：測(cè)定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.443、介質(zhì)中離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度高，Tm高，范圍變寬。G-C對(duì)中含有3個(gè)氫鍵，較A-T對(duì)中僅有2個(gè)氫鍵更為穩(wěn)定核酸的提取分離第17頁§5.2.4核酸測(cè)定1、紫外分光光度法2、定糖法：DNA、RNA經(jīng)酸水解后，嘌呤易脫下形成無嘌呤醛基化合物，或水解得到核糖和脫氧核糖→能與一些酚類、苯胺類化合物結(jié)合成有色物質(zhì)（簡(jiǎn)便，定性or顏色深淺定量）RNA＋濃鹽酸＋苔黑酚（3，5-二羥甲苯）共熱→綠色DNA＋濃醋酸＋少許濃硫酸＋二苯胺共熱→藍(lán)色3、定磷法：DNA含磷量9.2%，RNA含磷量9％1g磷相當(dāng)于11g核酸，消化后用鉬酸胺定磷試劑僅測(cè)得與嘌呤連接糖核酸的提取分離第18頁4、核酸分析時(shí)樣品預(yù)處理用定磷、定糖或紫外吸收方法測(cè)定某一生物材料中核酸或其水解物含量時(shí)，需先經(jīng)預(yù)處理→去掉雜質(zhì)，防止干擾1）將生物組織細(xì)胞在低溫下磨碎成勻漿→稀三氯乙酸or1％高氯酸低溫抽提幾次，得到沉淀為蛋白質(zhì)、核酸、脂類、多糖等2）用有機(jī)溶劑抽提去除脂溶性磷脂等物質(zhì)→不溶于酸非脂化合物如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷蛋白和少許磷化合物再采取酸（5％三氯乙酸或6％高氯酸，90oC，15min，再定糖法測(cè)定）或堿處理法（37oC，0.3-1mol/LNaOH，18h，DNA，RNA能夠分開）核酸的提取分離第19頁§5.3核酸作用與用途核酸作用：與生物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳和變異有親密關(guān)系，又是蛋白質(zhì)合成不可缺乏物質(zhì)→很多惡性腫瘤、遺傳性疾病及放射病均與核酸改變相關(guān)1、嘌呤和嘧啶類生化產(chǎn)品：核酸組成中堿基嘌呤化合物和嘧啶化合物都有良好抗腫瘤作用，阻斷蛋白質(zhì)、核酸生物合成，抑制癌細(xì)胞增殖，如：5-氟尿嘧啶2、核苷類生化產(chǎn)品：如輔酶A3、核苷酸類生化產(chǎn)品：如免疫核糖核酸iRNA、轉(zhuǎn)移因子核酸的提取分離第20頁§5.4動(dòng)物臟器核酸提取分離方法核酸及其衍生物類藥品，屬天然大分子，結(jié)構(gòu)復(fù)雜→采取生物材料為原料提取法制造核苷酸類及其衍生物，小分子，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單→化學(xué)合成法一、RNA提取分離動(dòng)物組織搗碎→勻漿→0.14mol/LNaCl溶液提取→調(diào)pH至4.5，RNA.蛋白↓，RNA與蛋白質(zhì)分開方法：1）乙醇沉淀法2）鹽酸胍和去污劑分離法3）酚法核酸的提取分離第21頁二、DNA提取分離利用核糖核蛋白在0.14mol/LNaCl可溶，而DNA核蛋白則可溶于水或高濃度鹽溶液（1mol/LNaCl）組織搗碎→

0.14mol/LNaCl重復(fù)洗滌以去除RNA（或0.1mol/LNaCl＋0.05mol/LNaCl枸櫞酸鈉）→去污劑SDS使蛋白質(zhì)變性→沉淀用1mol/LNaCl溶解→乙醇沉淀→去污劑精制，重復(fù)屢次常見去蛋白方法：含有新醇或異戊醇氯仿沉淀核蛋白→離心；SDS；苯酚處理，離心分層提取核酸時(shí)要注意保持其完整性（防過酸、堿、低溫）核酸的提取分離第22頁§5.5轉(zhuǎn)移因子制備Transferfactor（TF）一個(gè)多核苷酸和多肽小分子物質(zhì)，為細(xì)胞免疫促進(jìn)劑?？蓪⒐w細(xì)胞免疫性轉(zhuǎn)移給受體正常淋巴細(xì)胞，并能促進(jìn)釋放干擾素。臨床用于免疫缺點(diǎn)病人，如感染、皰疹、乙肝、麻疹等。對(duì)惡性腫瘤可作為輔助治療劑；作用無種屬特異性。制備TF原料除特異性供體白細(xì)胞外，普通采取正常人血液、脾和扁桃體等原料提取工藝中主要采取透析、柱層析、超濾及加絮凝劑和助濾劑再過濾等核酸的提取分離第23頁§5.6輔酶A提取輔酶A（CoenzymeA，CoA），是由等分子泛酸、腺嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸組成，ADP衍生物或類似物，相對(duì)分子量為767.54主要起傳遞酰基作用，往返接收和放出酰基，攜帶酰基部位在－SH上→以HSCoA表示對(duì)糖、脂類和蛋白質(zhì)代謝含有非常主要影響，作為白細(xì)胞降低癥、原發(fā)性血小板降低性紫癜、功效性低熱、脂肪肝、各種肝炎、冠狀動(dòng)脈硬化、心急梗塞等疾病主要輔助藥品核酸的提取分離第24頁§5.6輔酶A提取分離過程：預(yù)處理→提取→除蛋白→CMA樹脂純化→LD-601大孔吸附劑二次純化→濃縮、沉淀、干燥工藝過程中CoA定性跟蹤方法：硝基鹽巰基顯色法（CoA分子上巰基能與亞硝基鐵氰化物產(chǎn)生不穩(wěn)定強(qiáng)烈紅色）定量檢測(cè)方法：磺胺乙?；ê土姿徂D(zhuǎn)乙酰化酶（PTA）紫外分光光度法普通工藝制得CoA制劑，有