免疫組化顯色系統(tǒng)

免疫組化顯色系統(tǒng)免疫組化顯色系統(tǒng)第1頁(yè)免疫組化技術(shù)原理用標(biāo)識(shí)物或顯色物標(biāo)識(shí)抗體或抗原經(jīng)過免疫學(xué)中抗原與已知抗體反應(yīng)來(lái)檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)抗原成份免疫組化染色是一項(xiàng)綜合性技術(shù)組織材料準(zhǔn)備免疫組化染色前處理免疫組化染色(一抗,顯色系統(tǒng))免疫組化顯色系統(tǒng)第2頁(yè)免疫組化原理圖標(biāo)注解一抗1一抗2抗兔二抗抗鼠二抗組織抗原1抗原2過氧化物酶堿性磷酸酶雙染阻斷劑顯色劑(棕色)顯色劑(紅色)葡聚糖骨架分子免疫組化顯色系統(tǒng)第3頁(yè)回顧過去直接法二步間接法三步間接法酶免疫復(fù)合物法鏈親和素-生物素法(ABC)免疫組化顯色系統(tǒng)第4頁(yè)當(dāng)前常見顯色系統(tǒng)一步法:EPOS(EnhancedPolymerOne-StepStaining)二步法:EnVisionSystems雙染:GeneralDoublestain

三步法:LSAB(LabeledSstreptavidin-biotin)催化放大系統(tǒng):CSA(CatalyzedSignalAmplicationSystem)動(dòng)物研究試劑盒:ARK(AnimalResearchKit)免疫組化顯色系統(tǒng)第5頁(yè)一步法EPOS原理:

在一抗上經(jīng)過多聚骨架標(biāo)識(shí)過氧化物酶.即一抗上已標(biāo)識(shí)過氧化物酶.這種一抗與抗原結(jié)合后即可直接顯色.多聚骨架分子特異性一抗組織抗原過氧化物酶免疫組化顯色系統(tǒng)第6頁(yè)一步法EPOS主要試驗(yàn)流程組織片脫蠟,水化阻斷(S)TBS沖洗(S1968)一抗/HRP(U…)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)水漂洗素木精復(fù)染(S3309)免疫組化顯色系統(tǒng)第7頁(yè)一步法EPOS特點(diǎn):一抗孵育后直接顯色即用型試劑快速(一步)完成敏感性較差昂貴使用對(duì)象:要求快速出結(jié)果免疫組化試驗(yàn)對(duì)象免疫組化顯色系統(tǒng)第8頁(yè)二步法EnVision原理:

在葡聚糖大分子上標(biāo)識(shí)二抗及酶,將傳統(tǒng)二抗和三抗(酶)連接在一起,形成一個(gè)復(fù)合物EnVision.兩步孵育完成免疫組化.免疫組化顯色系統(tǒng)第9頁(yè)二步法EnVision原理圖一抗與抗原結(jié)合EnVision二抗復(fù)合物與一抗結(jié)合免疫組化顯色系統(tǒng)第10頁(yè)二步法EnVision主要試驗(yàn)流程阻斷內(nèi)過氧化酶(S)TBS沖洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)EnVision(Mo.K4001Rb.K4003)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)蘇木精復(fù)染(S3309)TBS沖洗(S1968)

免疫組化顯色系統(tǒng)第11頁(yè)二步法EnVision

特點(diǎn):

二抗及酶經(jīng)過葡聚糖連成一個(gè)大分子試劑(避開了傳統(tǒng)生物素與鏈親和素結(jié)合),不受內(nèi)源性生物素干擾.即用,方便,快速(兩步).敏感性強(qiáng).背景低.是當(dāng)前最理想免疫組化顯色系統(tǒng)使用對(duì)象可向全部做免疫組化用戶推薦.免疫組化顯色系統(tǒng)第12頁(yè)EnVision二步法雙染原理:

與EnVision二步法原理相同,只是為到達(dá)在同一組織上標(biāo)識(shí)兩種抗原.必需用兩種動(dòng)物起源一抗(常見抗小鼠和兔),分別配對(duì)應(yīng)EnVision(二抗),再用兩種顏色顯色劑顯色.免疫組化顯色系統(tǒng)第13頁(yè)EnVision二步法雙染原理圖鼠一抗接抗原1鼠EnV/HRP接抗鼠一抗DAB(顯色劑1)雙染阻斷劑兔一抗接抗原2兔EnV/AP接抗兔一抗FastRed(顯色劑2)免疫組化顯色系統(tǒng)第14頁(yè)EnVision二步法雙染主要試驗(yàn)流程阻斷內(nèi)過氧化酶(S)TBS沖洗(S1968)一抗(1Mo.)孵育TBS沖洗(S1968)EnVision/HRP(1Mo.)TBS沖洗(S1968)顯色劑1DAB(K3467)蒸餾水沖洗雙染阻斷劑(Kit含)一抗(2Rb.)孵育TBS沖洗(S1968)EnVision/AP(2Rb.)TBS沖洗(S1968)顯色劑2FastRead(K0597)蒸餾水沖洗蘇木精復(fù)染(S3309)免疫組化顯色系統(tǒng)第15頁(yè)EnVision二步法雙染特點(diǎn):即用,方便,快速,省時(shí).敏感性強(qiáng).背景低.在同一組織切片上,用兩種不一樣標(biāo)識(shí)物標(biāo)識(shí)兩種不一樣抗原.使用對(duì)象需在同一張切片上標(biāo)識(shí)兩種抗原者主要是形態(tài)學(xué)科研人員免疫組化顯色系統(tǒng)第16頁(yè)三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)

原理:

應(yīng)用生物素標(biāo)識(shí)二抗與過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)識(shí)鏈親和素(Streptavidin)親和作用,連接一抗及抗原,形成大分子.再經(jīng)過對(duì)應(yīng)酶底物(顯色劑)作用使之顯色.免疫組化顯色系統(tǒng)第17頁(yè)三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)原理圖:一抗與抗原結(jié)合二抗/Bio與一抗結(jié)合STPA/HRP(AP)與二抗/Bio結(jié)合免疫組化顯色系統(tǒng)第18頁(yè)三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)主要試驗(yàn)流程

阻斷內(nèi)過氧(S)TBS沖洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)TBS沖洗(S1968)

TBS沖洗(S1968)二抗/生物素(Mo.E354Rb.E353)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)FastRead(K0597或K0699)蘇木精復(fù)染(S3309)鏈親和素/HRP或AP蒸餾水沖洗免疫組化顯色系統(tǒng)第19頁(yè)三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)特點(diǎn):廉價(jià)有現(xiàn)成兔,鼠,羊通用試劑盒會(huì)有內(nèi)源性生物素造成非特異性背景使用對(duì)象可向全部做免疫組化用戶推薦.免疫組化顯色系統(tǒng)第20頁(yè)催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

原理在經(jīng)典三步法免疫組化放大基礎(chǔ)上,經(jīng)過生物素化酪胺催化,將又一次加入酶標(biāo)識(shí)鏈親和素(Streptavidin-enzyme)與二抗中生物素親和,使已放大分子再一次放大.免疫組化顯色系統(tǒng)第21頁(yè)催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

原理圖一抗與抗原結(jié)合二抗/Bio與一抗結(jié)合STAV/Bio與二抗/Bio結(jié)合放大液催化加入STAV/HRP與Bio再結(jié)合免疫組化顯色系統(tǒng)第22頁(yè)催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

主要試驗(yàn)流程:

阻斷內(nèi)過氧(S)水洗TBS沖洗(S1968)二抗孵育(Rba-Mo/Bio)TBS沖洗(S1968)

放大液(Kit含)鏈親和素/生物素Strep./Bio(Kit含)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(Kit含)蘇木精復(fù)染(S3309)鏈親和素/過氧化物酶Strep./HRP(Kit含)蒸餾水沖洗蛋白阻斷劑(Kit含)一抗孵育(Mo)TBS沖洗(S1968)TBS沖洗(S1968)TBS沖洗(S1968)免疫組化顯色系統(tǒng)第23頁(yè)催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

特點(diǎn):敏感性極強(qiáng)試驗(yàn)步驟較多較貴使用對(duì)象:需做免疫組化試驗(yàn)者,尤其適合用于一些石蠟片不易出結(jié)果一抗.免疫組化顯色系統(tǒng)第24頁(yè)動(dòng)物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)原理在一抗與組織抗原反應(yīng)之前:小鼠一抗F(c)與生物素化抗小鼠F(ab)片斷結(jié)合,再加入小鼠免疫球蛋白,中和未被結(jié)合生物素化抗小鼠F(ab).用該復(fù)合物再與小鼠組織中特異抗原反應(yīng),可降低非特異性背景.免疫組化顯色系統(tǒng)第25頁(yè)動(dòng)物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)原理圖小鼠一抗抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫復(fù)合物/Bio和游離抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫復(fù)合物/Bio和游離抗小鼠IgF(ab)/Bio小鼠Ig免疫復(fù)合物/Bio和被中和抗小鼠IgF(ab)/Bio與組織抗原結(jié)合按LSAB法繼續(xù)免疫組化染色免疫組化顯色系統(tǒng)第26頁(yè)動(dòng)物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)主要試驗(yàn)步驟一抗與組織抗原反應(yīng)之前需做試劑預(yù)處理:小鼠一抗+抗小鼠IgF(ab)/Bio復(fù)合物1復(fù)