轉(zhuǎn)錄組測(cè)序遺傳進(jìn)化項(xiàng)目方案

研究背 材料與方 材料和技術(shù)路 研究?jī)?nèi) SNP分 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化 群體結(jié)構(gòu)分 PCA分 ka/ks分 差異表達(dá)分 差異表達(dá)和正選擇功能注釋和富集分 共表達(dá)分析 技術(shù)路線可行 方案的可行 創(chuàng)新 豐富的項(xiàng)目經(jīng) 、變化的適應(yīng)種適應(yīng)新的環(huán)境、人工馴化下動(dòng)植物生殖生理或神經(jīng)行為的改、因，且探索這些對(duì)不同表型的作用機(jī)制；通過SNP分析以及選擇分析，篩選 RNA整體與參 （有參

與 （無參序列水 表達(dá)水

SNP選

分

TotalRNA本研究提取XX部位的RNA進(jìn)序分析（腹部的內(nèi)臟、等因素會(huì)4RNARNA降解程度Qubit濃度進(jìn)行精確定量；Agilent2100精確檢測(cè)RNA的完整性。Oligo（dT）mRNAfragmentationbuffermRNAmRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（randomhexamers）cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二條cDNA鏈，利用AMPureXPbeads純化cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接接頭，然后用AMPureXPbeads進(jìn)行片段大小選擇。PCRcDNA2100insertsize進(jìn)行檢測(cè)，insertsizeQ-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效上機(jī)庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行HiSeq4000，讀長(zhǎng)為PE150bp，每個(gè)文庫(kù)測(cè)XXG數(shù)據(jù)量Unigene庫(kù)構(gòu)建和利用Trinity軟件對(duì)每一個(gè)物種的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行denovo組裝。有參考組直接TopHat軟件進(jìn)行序列分析。直系同源篩主要是前者使用了Exonerate2.2.0SNP分利用針對(duì)轉(zhuǎn)錄組的比對(duì)軟件STAR對(duì)每個(gè)樣本的reads與參考組序列或unigeneGATK針對(duì)RNA-seqSNPcalling流程，查找單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）位點(diǎn)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育ape軟件包，neighbor-joining和最大似然算法等，進(jìn)行樣品的進(jìn)化分析，計(jì)算得到群體的進(jìn)PCA分ka/ks分與同義突變率的比值(Ka/Ks)可以判斷是否有選擇壓力作用于這個(gè)蛋白質(zhì)編碼。如果列以計(jì)算Ka、Ks、Ka／Ks來篩選與性狀相關(guān)的正選擇。差異表達(dá)利用FPKM值計(jì)算表達(dá)量，比較不同材料間的差異表達(dá)。并對(duì)不同組合間的差異表達(dá)取并集進(jìn)行表達(dá)量聚類分析，如下圖：功能注釋和富集對(duì)分析得到的差異表達(dá)和正選擇進(jìn)行一系列功能注釋（GO、COG、KEGG等七大趣性狀的功能。左圖為GO富集分析，右圖為KEGG通路富集分析。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（A）作為一種挖掘和呈現(xiàn)在不同樣本中表達(dá)形式的方案的可最近發(fā)展起來的利用深度技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的方法(wangetal.,2009)不依賴物種，轉(zhuǎn)錄組使用在組裝全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本方面具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的Trinity組裝軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組Denovo拼接確保轉(zhuǎn)錄組組裝的準(zhǔn)確性和完整性百邁客公司在轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)豐富，mRNA-seq和后續(xù)信息學(xué)分析等方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。的重要目前轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)基礎(chǔ)研究醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)等各34個(gè)發(fā)育梯度部分(葉基區(qū)、過渡區(qū)、正在成熟區(qū)和成熟區(qū))，并從葉尖中分離出維管束鞘細(xì)胞群和葉肉細(xì)胞群，共對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。得到約120M的序列讀長(zhǎng)去界定的結(jié)構(gòu)和可變剪接并且在不同發(fā)育梯度的葉片中及在成熟葉片的維管束鞘和葉肉細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本豐度的定量分析檢測(cè)到大部分存在不同的mRNA加工，發(fā)現(xiàn)在葉片不同發(fā)育梯度中有64%的呈現(xiàn)差異表達(dá)，而21%的在維管束C44個(gè)區(qū)域進(jìn)行研究，為今后開展光合作用發(fā)育相關(guān)研究Grahametal（2010）選用兩個(gè)高度雜合且型差異很大的青蒿品種C4與C1作為親本品種構(gòu)建了F1群體利用Roche/454平臺(tái)對(duì)青蒿(Artemisiaannua)F1群體的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，得到了大量的SNPs(1SNP/104bp)，從中選取1536個(gè)SNPs，結(jié)合其他已有marker用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。將型數(shù)據(jù)與表型青蒿素濃度相關(guān)聯(lián)，找到3QTLs位點(diǎn).LG1LG9QTLLG4上的QTLLiuetal(2012)通過選取麻竹不同組織的材料（、花、葉、莖、嫩枝、根，提取注釋的與近緣物種進(jìn)行比較分析；預(yù)測(cè)了105個(gè)可能編碼8種木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶的基Hanetal(2013)通過對(duì)山蒼子不同組織及果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組，68,648Unigenes，N50838bpSSR2,674Unigene進(jìn)行功能注釋及分類。另外在山蒼子及其他植物中進(jìn)行TPS物合成候選16個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。S.pennellii、S.habrochaites和S.pimpinellifolium進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，揭示了栽培番茄和野生番茄在序列水平和表達(dá)水平的變異對(duì)這些品種的轉(zhuǎn)錄組的進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)了進(jìn)化瓶頸的影響，研究人員還發(fā)現(xiàn)，與果色相關(guān)的在人工培育的紅色果肉的番茄中及綠其與耐旱，耐熱和鹽度相關(guān)的均出現(xiàn)了加速進(jìn)化，闡明了栽培番茄和近緣野生番茄在轉(zhuǎn)創(chuàng)新、基于高通量的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可用于缺少組序列信息的非模式物種中轉(zhuǎn)錄組的denovo組裝表達(dá)水平分析、差異表達(dá)篩選、功能挖掘及遺傳進(jìn)化分析的重要。、基于轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析也是最近剛出現(xiàn)的一個(gè)新的研究方向與基于組創(chuàng)建復(fù)雜表型，能夠提供更為直接的；含子區(qū)域，同時(shí)極大減少了量，降低了成本，也縮短了項(xiàng)目周期。通過對(duì)不同品種的不同組織材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組可產(chǎn)生一個(gè)高分辨率和高準(zhǔn)確性的轉(zhuǎn)豐富的項(xiàng)目經(jīng)合作單位百邁客生物科技是具有高通量技術(shù)和生物信息學(xué)服務(wù)的高新技術(shù)企業(yè)，司的產(chǎn)品廣泛應(yīng)用全組、遺傳圖譜構(gòu)、全關(guān)聯(lián)分析、轉(zhuǎn)錄組重小NA等領(lǐng)域先后成SLA-eq通量記開發(fā)型技術(shù)、遺傳圖譜建軟件Hghap等軟開發(fā)和8條生信息分析務(wù)線流的構(gòu)建申請(qǐng)獲得一項(xiàng)專利專利號(hào)ZL2001 .）和20軟件著作。對(duì)獼桃成果已《aueounaon》功能的研究及