抗體工程技術

關于抗體工程技術第1頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月2、抗體類型1、多克隆抗體(polyclonalantibody)

早期人工制備抗體的主要方法，以相應抗原免疫動物，由此產(chǎn)生的抗體是針對多種抗原決定簇（表位）的混合抗體，故稱之為多克隆抗體。

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第一節(jié)抗體制備第2頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月3優(yōu)點：來源廣泛、制備容易缺點：特異性不高、易發(fā)生交叉反應第3頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月4多克隆抗體1890年Behring和Kitasato發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立免疫療法，開創(chuàng)了抗體制藥之先河。白喉外毒素→免疫動物→抗毒素→治白喉Behring(德,1854～1917）第4頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月5目前治療性抗體產(chǎn)品：精制破傷風毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。

綠膿免疫血漿抗體制劑第5頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月6多克隆抗體的制備根據(jù)不同的免疫原，選擇不同的免疫方案。免疫方案免疫途徑免疫程序動物選擇第6頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月7

細胞融合，又稱體細胞雜交是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜融合形成單個細胞的過程。在適當?shù)臈l件下，細胞融合在一起，產(chǎn)生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞，稱為雜交細胞（hybridcell）。2、細胞融合技術和單克隆抗體第7頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月8顯微鏡下細胞融合過程第8頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月9Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象。1958年日本學者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細胞融合的效應。1974年華裔加拿大學者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產(chǎn)生能分泌預定單克隆抗體的雜交瘤細胞。20世紀80年代出現(xiàn)了電融合技術。細胞融合研究進展第9頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月101975年，Kohler和Milstein應用小鼠骨髓瘤細胞和綿羊細胞致敏的小鼠脾細胞融合，得到的一部分融合雜交細胞既能繼續(xù)生長，又能分泌抗羊紅細胞抗體，將這種雜交細胞系統(tǒng)稱為雜交瘤細胞，應用這種方法可制備單一抗原決定簇的單克隆抗體。第10頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月11一、何謂單克隆抗體？第11頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月12

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由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體，稱單克隆抗體第12頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月13第13頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月14第14頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月15第15頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月16單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridomatechnology

）。第16頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月17NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

第17頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月18雜交瘤技術的基本原理第18頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月19

3、基因工程抗體基因工程抗體即將抗體的基因按不同需要進行加工、改造和重新裝配，然后導入適當?shù)氖荏w細胞中進行表達的抗體分子。

第19頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月20基因工程抗體與單克隆抗體相比的優(yōu)點：

通過基因工程技術的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應?；蚬こ炭贵w的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進入病灶的核心部位；根據(jù)治療的需要，制備新型抗體。可以采用原核細胞、真核細胞和植物等多種表達方式，大量表達抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。第20頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月21整體水平抗體生成技術細胞工程抗體生成技術

基因工程抗體生成技術多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術

噬菌體抗體庫技術Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達技術第21頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月22

經(jīng)過免疫的哺乳類動物單一的B淋巴細胞，可以合成分泌單一性的抗體，我們稱這種具有特異性的、同質(zhì)性的抗體為單克隆抗體。二、McAb技術基本原理第22頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月23改變B淋巴細胞遺傳特性建立永久生長和能分泌McAb細胞系的途徑

病毒轉(zhuǎn)化細胞雜交第23頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月24骨髓瘤細胞選擇骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第24頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月25*融合細胞的選擇原理

1964年Litterlefield首先發(fā)明HAT選擇性培養(yǎng)基。

H：Hypoanthine次黃嘌呤

A：Aminopterin氨基喋呤

T：Thymidine胸腺嘧啶脫氧核苷原理：正常細胞不但具有利用培養(yǎng)液中的谷酰胺和尿核苷單磷酸合成DNA的能力,且當這條主要途徑被氨基喋呤（A）阻斷時，還具有利用培養(yǎng)液中現(xiàn)成的次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的作用下，借此替代通路來合成DNA的能力。第25頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月26三、McAb技術的特點1、高度特異性2、高度穩(wěn)定性

3、高抗體活性

4、不可知性5、過于單一性第26頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月27★四、McA制備的基本方法

（一）抗原提純與動物免疫第27頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月28（二）骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞SP2／0(HGPRT缺陷株)的準備脾細胞的準備第28頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月29融合前骨髓瘤細胞:細胞狀態(tài)渾圓透亮、大小均一、邊緣清晰、排列整齊、呈半致密分布第29頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月30（三）細胞融合融合過程須注意問題1、細胞比例：骨髓瘤細胞與脾細胞比例為1：42、反應時間：混合細胞的離心管中30s內(nèi)加入1ml37℃預溫的50％PEG，邊加邊輕輕搖動離心管，作用90s，然后加入預溫的37℃的DMEM不完全培養(yǎng)液終止PEG作用，800r/min離心6min，棄上清。3、培養(yǎng)液成分第30頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月31（四）篩選和克隆有限稀釋法(稀釋至0.8個細胞/孔)（五）單克隆抗體的制備和凍存（六）單克隆抗體的純化（制備方法：體內(nèi)培養(yǎng)、體外培養(yǎng)）（鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、

親和層析、酸沉淀）第31頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月32★四、McA制備的基本方法

第32頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月33★五、單克隆抗體的應用1、作為親合層析的配體2、作為生物治療的導向武器3、作為免疫抑制劑

通過親和層析可從復雜的混合物中分離、純化某一特定成分McAb所帶藥物只作用于靶組織器官抗人的T淋巴細胞單抗用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應第33頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月344、作為研究工作中的探針5、增強抗原的免疫原性6、作為醫(yī)學檢驗試劑（1）診斷各類病原體（2）腫瘤特異性抗原和相關抗原檢測（3）檢測淋巴細胞表面標志（4）機體微量成分的測定第34頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月35CJPEB1重組蛋白的表達及

單克隆/多克隆抗體的制備鑒定第35頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月36課題的思路及目的誘導培養(yǎng)基因工程菌E.coliBL21(DE3)高效表達CJPEB1重組蛋白鎳瓊脂糖層析柱純化表達后的重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備單抗免疫新西蘭兔制備多抗為建立血清學方法檢測CJ創(chuàng)造條件

第36頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月37一、SDS鑒定純化后的PEB1蛋白123456M78910圖1.SDS–PAGE鑒定純化后的PEB1蛋白

表達的蛋白通過鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化后，經(jīng)SDS鑒定，蛋白質(zhì)分子量大小與預計的理論值相符，和本室前期的研究結果一致，PEB1重組蛋白純度高。1～2：咪唑濃度為50mmol/L時洗脫的蛋白3～4：咪唑濃度為100mmol/L時洗脫的蛋白5～6：咪唑濃度為200mmol/L時洗脫的蛋白M：蛋白質(zhì)標準分子量7～8:咪唑濃度為300mmol/L時洗脫的蛋白9～10:咪唑濃度為400mmol/L時洗脫的蛋白97.4kd66.2kd42.7kd31kd14.4kd第37頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月38PEB1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定常規(guī)免疫BALB/C小鼠制備單克隆抗體第38頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月39-a-b-c-d

-a

-b

-c

-d抗原決定簇BALB/Cabbcd

脾臟產(chǎn)生各種

B細胞與佐劑乳化免疫采血收集血清作為篩選時陽性對照無菌取脾臟收集B細胞抗原通常有多個抗原決定簇免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射四次PEB1蛋白第39頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月40-d-a-b-c-dPEB1蛋白ELISAHATPEG細胞融合雜交瘤細胞（亞克?。?/p>

(確定只有單個細胞)-d-c-b-a-dSP2/0骨髓瘤細胞Bcell脾細胞培養(yǎng)篩選只識別一個抗原決定簇

abbcd合混胞細選篩抗單第40頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月41單克隆抗體的獲得及鑒定細胞克隆的形成和雜交瘤細胞的篩選

圖2.融合后第二天骨髓瘤細胞對照孔圖3.融合后第二天細胞融合孔第41頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月42圖4.融合后第三天細胞融合孔圖5.融合后第八天細胞融合孔第42頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月43

圖6.間接ELISA篩選抗體陽性孔

第43頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月44

通過有限稀釋法和ELISA法進行連續(xù)克隆篩選后獲得兩株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細胞株，分別命名為1D7A5株和5G2B3株。第44頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月45

圖8.1D7A5株分泌抗體的亞型圖9.5G2B3株分泌抗體的亞型第45頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月46

1D7A5株和5G2B3株雜交瘤細胞誘生的腹水經(jīng)間接ELISA法檢測，腹水中的抗體效價分別為1:8×104和1:5×104。

兩株雜交瘤細胞誘生的腹水經(jīng)雙向瓊脂擴散試驗檢測，腹水中的抗體效價均為1:8。第46頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月47運用小鼠單抗分型試劑盒確定雜交瘤細胞所分泌的單抗的亞型。將建株的雜交瘤細胞注入小鼠腹腔誘生腹水。應用間接ELISA法和雙向瓊脂擴散試驗檢測的腹水中單抗的效價。通過Western-blot和玻片凝集試驗檢測單抗的特異性。第47頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月48免疫印跡試驗結果顯示：2株雜交瘤細胞分泌的單抗，可以與PEB1蛋白特異性結合。通過DAB顯色出現(xiàn)特異性條帶并且無雜帶出現(xiàn)。1234M

1～2：未經(jīng)純化的PEB1蛋白與單抗特異性結合3～

4：純化的PEB1蛋白與單抗特異性結合M：蛋白質(zhì)標準分子量圖10.western-blot檢測單抗特異性97.4kd66.2kd43kd31kd20kd14.4kd第48頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月49細菌名稱雜交瘤細胞誘生的腹水SP2/0細胞誘生的腹水空腸彎曲菌++－大腸桿菌－－痢疾桿菌－－傷寒桿菌－－產(chǎn)氣莢膜桿菌－－變形桿菌－－葡萄球菌－－表1.玻片凝集試驗檢測單抗的特異性結果第49頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月50三、PEB1蛋白多克隆抗體的制備及鑒定免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。第50頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月51123412431234PEB1蛋白與佐劑完全乳化待血凝完全離心收集血清鹽析法粗提兔IgG抗體第51頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月52應用間接ELISA法和雙向瓊脂擴散試驗檢測多克隆抗體抗體的效價。通過Western-blot和玻片凝集試驗檢測多克隆抗體的特異性。第52頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月53

多克隆抗體的效價檢測及鑒定動物編號0W2W4W6W7W8W兔101:101:102

1:6×1031:8×1031:1.5×104兔201:101:5×102

1:8×1031:1×1041:2×104兔301:101:5×1021:8×1031:1.2×1041