臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展

臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展一、臨床微生物病原體的快速診斷雖然對“快速”的時(shí)間長短沒有正式的定義，但是大多數(shù)人期望快速的系統(tǒng)能在4h內(nèi)提供可用的結(jié)果。通常微生物的繁殖時(shí)間（通常是30min或更長時(shí)間）不允許那些依賴微生物生長與否的檢測方法，在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生可檢測的生化反應(yīng)。為了克服這一問題，必然使用全新的底物，檢測待測菌產(chǎn)生的酶或蛋白質(zhì)，從而在1～4h內(nèi)檢測出應(yīng)答反應(yīng)。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（一）細(xì)菌與真菌的快速診斷1、質(zhì)譜技術(shù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測技術(shù)經(jīng)典的利用酶學(xué)的生化反應(yīng)技術(shù)

生化反應(yīng)

編碼技術(shù)

碳指紋技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOFMS）臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展BrukerDaltonik,microflexBiotyper(Billerica,MA,USA)bioMerieuxVitekMS(Durham,NC,USA)theAndromasSAS(Paris,France).TheformertwoinstrumentsareavailableintheUSAandreceivedclearancefromtheFoodandDrugAdministration(FDA)forcertaingroupsofmicroorganisms.臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（1）在需氧/兼性厭氧的革蘭陽性桿菌應(yīng)用棒桿菌屬菌可準(zhǔn)確鑒定。MALDITOFMS可以鑒定分枝桿菌，這種檢測需要特殊處理以殺滅待測菌（出于安全等考慮）、打散細(xì)胞聚集團(tuán)塊以及裂解細(xì)胞外壁（envelopes）等。MALDITOFMS應(yīng)該能夠鑒定大多數(shù)臨床相關(guān)的分枝桿菌菌種。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（2）在需氧/兼性厭氧的革蘭陽性球菌應(yīng)用MALDI-TOFMS對葡萄球菌（Staphylococci）、β-溶血性鏈球菌(b-hemolyticstreptococci、氣球菌(Aerococci和腸球菌(Enterococci)的整體鑒定性能都是極佳的。而對一些α-溶血性鏈球菌(a-hemolyticstreptococci)有困難。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展布魯克系統(tǒng)可能難以區(qū)分緩癥鏈球菌(S.mitis)、口腔鏈球菌(S.oralis)與肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)

；而VITEKMS系統(tǒng)則可以克服這一局限。盡管MALDI-TOFMS在種群水平上能夠可靠地鑒別草綠色鏈球菌(viridansgroupstreptococci)，但它可能無法區(qū)分一些密切相關(guān)的種。其它鏈球菌，如乳鏈球菌(S.canis)、停乳鏈球菌停乳亞種(S.dysgalactiae)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)和S.infantarius、馬腸鏈球菌(S.equinus)和S.lutetiensis等，彼此可能無法很好地區(qū)分開來。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（3）在需氧/兼性厭氧的革蘭陰性桿菌應(yīng)用陰溝腸桿菌復(fù)合體植生拉烏爾菌、解鳥氨酸拉烏爾菌巴策爾弓形桿菌彎曲桿菌種小腸結(jié)腸炎耶爾森菌二氧化碳嗜纖維菌洋蔥伯克霍爾德菌氣單胞菌HACEK菌群臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展沙門菌屬內(nèi)鑒定通常是不可行的，但是它可區(qū)分Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphi和其它S.entericaserovars。ShigellaandE.coliaresocloselyrelatedthatShigellaisnotidentifiedbyMALDI-TOFMS.Todifferentiate,coloniesshouldbeexaminedforlactosefermentation,motilityandaspotindole.IfpositiveanidentificationofE.coliisappropriate.Ifnegativeforthesetests,ShigellashouldbesuspectedandanagglutinationwithShigellaantiseraperformed.臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（4）在厭氧菌應(yīng)用MALDI-TOFMS技術(shù)可用于鑒定許多臨床相關(guān)的厭氧菌。Jamal等報(bào)道使用布魯克v3.3和生物梅里埃v1系統(tǒng)/v1.1數(shù)據(jù)庫對274株常規(guī)分離厭氧菌（多屬于Bacteroidesfragilis）的鑒定準(zhǔn)確率分別為89%和100%。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（5）在酵母菌應(yīng)用MALDI-TOFMS可以鑒定酵母菌，且性能優(yōu)于一些傳統(tǒng)的表型鑒定系統(tǒng)。它可以鑒別都柏林假絲酵母菌(C.dubliniensis)和白假絲酵母菌(C.albicans)；皺折假絲酵母菌(C.rugosa)和近鄒褶假絲酵母菌(C.pararugosa)；挪威假絲酵母菌(C.norvegensis)、克柔假絲酵母菌(C.krusei)和平常假絲酵母菌（C.inconspicua、）；近平滑假絲酵母菌(C.parapsilosis)、C.orthopsilosis

和C.metapsilosis；帶補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫時(shí)可以鑒別新生隱球菌（C.neoformans）和格特隱球菌（C.gattii）。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（6）在絲狀真菌應(yīng)用絲狀真菌的表型易變，其蛋白質(zhì)譜可隨生長條件及分析菌絲區(qū)域的不同而變化，目前的商業(yè)數(shù)據(jù)庫少有涉及這些菌。DeCarolis等人使用布魯克Biotyper系統(tǒng)開發(fā)了曲霉菌（Aspergillusspecies）、鐮刀菌（Fusariumspecies）和毛霉菌（Mucorales）的數(shù)據(jù)庫，并用于94株菌的鑒定，其種水平的正確率高達(dá)97%。Iriart等人利用VITEKMSv1系統(tǒng)/v1.1數(shù)據(jù)庫和直接上板測試操作，成功鑒定了44株曲霉菌中的82%的菌（包括數(shù)據(jù)庫中存在的所有菌株）。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（7）臨床標(biāo)本的直接檢測血液感染尿液感染臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展2、細(xì)菌、病毒及其它病原體基因型快速診斷（1）DNA靶向測序?qū)τ诩兣囵B(yǎng)的微生物可以進(jìn)行DNA序列的靶向測序。靶基因的保守區(qū)往往是PCR引物和DNA測序引物退火結(jié)合的區(qū)域。可變區(qū)具有獨(dú)特的核苷酸序列，從而實(shí)現(xiàn)基于測序的特定菌株屬和種的鑒定。鑒定細(xì)菌最常用的靶序列是16SrRNA基因（16SrDNA）。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展（2）電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)應(yīng)用于PCR產(chǎn)物的分析它檢測的是經(jīng)PCR擴(kuò)增后的廣譜基因（例如rRNA）和特定基因的質(zhì)量，而非細(xì)菌蛋白質(zhì)的質(zhì)量。電噴霧離子化質(zhì)譜的檢測精度能夠確保通過檢測擴(kuò)增DNA的質(zhì)量，精確地計(jì)算出擴(kuò)增DNA的核苷酸組分。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展3、復(fù)合感染病原體的快速診斷PCR-液相芯片/固相芯片雜交技術(shù)。市場已見產(chǎn)品有LuminexxMAP和bioMérieuxFilmArray。一次可以檢測多個病原體（細(xì)菌、真菌、病毒與寄生蟲）；也可以檢測不同類別的感染標(biāo)本（血液、呼吸道分泌物、糞便與腦脊液）。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展標(biāo)記熒光素待測PCR擴(kuò)增片段交聯(lián)有基因探針的編碼微球臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展二、臨床微生物感染的快速診斷1、G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、隱球菌莢膜多糖抗原由于廣譜抗生素的使用、侵襲性操作、腫瘤放化療及老年患者免疫功能的下降，導(dǎo)致侵襲性真菌感染不斷增加，真菌形態(tài)學(xué)及鑒定（生化反應(yīng)）困難，有關(guān)侵襲性真菌感染需要開展G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、隱球菌莢膜多糖抗原檢測?？梢赃_(dá)到快速診斷侵襲性真菌感染并區(qū)分其感染的病原體。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展2、內(nèi)毒素與外毒素內(nèi)毒素和外毒素是細(xì)菌產(chǎn)生的兩大類毒素物質(zhì)。內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，它是磷酸一多糖一蛋白質(zhì)的復(fù)合物。主要成分為脂多糖。其性質(zhì)較穩(wěn)定、耐熱、毒性比外毒素低、其作用沒有組織器官選擇性，不同病原菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素引起的癥狀大致相同，都能引起機(jī)體體溫升高、腹瀉和出現(xiàn)出血性休克和其他組織損傷現(xiàn)象。外毒素是病原菌在代謝過程中分泌到菌體外的物質(zhì)。產(chǎn)生外毒素的細(xì)菌主要是一些革蘭陽性細(xì)菌，少數(shù)革蘭陰性菌如霍亂弧菌和產(chǎn)毒性大腸桿菌等也能產(chǎn)生外毒素。目前臨床微生物檢驗(yàn)?zāi)軌蜷_展的是內(nèi)毒素，難辨梭狀芽胞桿菌A、B毒素，幽門螺桿菌尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)基因CagA和空泡毒素VacA的檢測。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展3、病原體IgM病原體感染刺激機(jī)體產(chǎn)生早期IgM和恢復(fù)期IgG，IgM對于快速的早期感染診斷具有一定價(jià)值，目前檢測包括嗜肺軍團(tuán)菌(LP)、肺炎支原體(MP)、Q熱立克次體(COX)、肺炎衣原體(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒1、2和3型(PIVS)。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展4、超敏C反應(yīng)蛋白、炎癥細(xì)胞因子、PCT聯(lián)合檢測有助于感染類型的甄別。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展三、病原體快速藥敏試驗(yàn)經(jīng)典的藥敏試驗(yàn)有K-B紙片擴(kuò)散法、微量液體稀釋法和E-test，孵育18～24h判讀結(jié)果，不能滿足臨床需要。dRAST通過微孔和微