演示文稿基因克隆與表達

（優(yōu)選）基因克隆與表達目前一頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點

目的基因-T表達載體

酶切，膠回收，連接

轉化到克隆用細胞（Top10)

提質粒，酶切驗證轉化到表達用細胞（BL21（DE3)）

誘導表達

SDS目前二頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點DNA中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。1）.DNA的純度

影響限制性內切酶活性的因素2）.DNA的甲基化程度

dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。目前三頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點3）.溫度

不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。是影響限制酶活性的重要因素。4）.緩沖液(Buffer)商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。MgCl2、NaCl/KCl：

提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：

維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；β－巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活。目前四頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點用時在冰上操作；取酶用干燥、滅菌、新的槍頭酶用量不能超過酶切總體積的10%；多種酶進行酶切時，先低鹽后高鹽緩沖液；關心小貼士告訴你使用時注意事項：目前五頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點連接、轉化與重組子鑒定1、連接目前六頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：

NAD+（2）.連接條件目前七頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點

ATP：反復凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；單價離子：150-200mMNaCl，提高連接效果；

PEG：5%以下可以提高連接效率連接效果最好在37℃，但形成的互補不穩(wěn)定;最佳連接溫度：12-16℃，較好的連接效果，互補又較穩(wěn)定;2）連接溫度：3）反應液中的成分：目前八頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點目的或作用：4）插入片段與載體的濃度比例

載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1﹕3左右，甚至1﹕10或更高。增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。目前九頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點

化學法（CaCl2法)：轉化原理：是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，質?；駾NA重組分子便可進入細胞內（感受態(tài)細胞）。2、轉化目前十頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點影響轉化率的主要影響因素:載體本身的性質及其空間構象：超螺旋構象轉化率最高；插入片段的大?。翰迦肫卧酱螅D化效率越低；受體細胞的類型及預處理；轉化方法：電擊法高于化學法。目前十一頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori限制性酶切圖譜法3、轉化子的篩選和鑒定目前十二頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點質粒DNA的提取基因組DNA質粒DNA質粒具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。目前十三頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點ⅰ質粒DNA提取方法：堿裂解法、煮沸法、SDS法等ⅱ

堿裂解法原理：

在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結構破壞變性，環(huán)狀超螺旋質粒不充分變性。在中性條件下變性質?；謴驮瓉順嬓停€性大分子細菌DNA不能復性呈不溶物而經離心除去。目前十四頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點ⅲ抽提出質粒的構型：1）超螺旋質粒DNA:在提取質粒過程中，超螺旋DNA占大部分。2）開環(huán)質粒DNA：如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA。3）線狀質粒DNA：如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA。目前十五頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點抽提出的質粒三種構型電泳結果：1）開環(huán)

2）線狀

3）超螺旋+-電泳方向目前十六頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點凝膠電泳技術電泳目的：對核酸分子進行分離和檢測目前十七頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點?凝膠分辨DNA的能力：

瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠濃度分辨范圍(kb)濃度分辨范圍(bp)0.3%5-603.51000-20000.6%1-20590-500

0.7%0.8-108.060-400

0.9%0.5-71240-200

1.2%0.4-61525-1601.5%0.2-3206-100凝膠濃度:濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳凝膠濃度的選擇：取決于待檢測的DNA的大小原來如此！目前十八頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點電泳緩沖液

pH值：偏堿性，帶負電荷

離子濃度：離子濃度高電流大發(fā)熱快膠溶解種類：TAE（Tris+EDTA+醋酸）:電流大，易產生離子富集TBE

（Tris+EDTA+硼酸）:緩沖能力最強TPE（Tris+EDTA+磷酸）:緩沖能力低TNE（Tris+EDTA+醋酸鈉）目前十九頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點pET表達載體目前二十頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點目前二十一頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點目前二十二頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點目前二十三頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點pET表達載體的啟動子是T7噬菌體基因10啟動子（T7啟動子），需要T7RNA聚合酶才能轉錄。T7RNA聚合酶轉錄機制十分有效并具有選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；在非誘導條件下，幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉錄。T7RNA聚合酶基因插入由大腸桿菌lacUV5啟動子控制、λDE3溶原狀態(tài)下的大腸桿菌染色體上。目前二十四頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點T7表達系統(tǒng)轉錄調控的機理

化學誘導型噬菌體DE3是

l噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI、lacUV5

啟動子和T7RNA聚合酶基因的

DNA片段被插入其

int基因中

用噬菌體DE3的溶源菌作為表達載體的宿主菌，調控方式為

化學誘導型，類似于Lac表達系統(tǒng)。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動子E.Coli（DE3）T7啟動子

目的基因T7RNA

聚合酶IPTG誘導目前二十五頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點BL21:lon,ompT

BL21(DE3):T7polymeraseRosetta:optimalcodonsOrigami:thioredoxinreductase(trxB),glutathionereductase(gor)Rosetta-gami

OrigamiB:(IPTGconcentrationdependent)菌株種類目前二十六頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點基本原理

SDS技術是根據(jù)SDS能使蛋白質變性解聚成肽鏈并與肽鏈側鏈以一定比例結合成SDS—肽鏈復合體，從而掩蓋了肽鏈本身所帶電荷（SDS帶負電），并消除了蛋白質分子間的形狀差異，再結合PAGE技術（根據(jù)分子的形狀、電荷、分子量綜合差異來分離不同分子的技術）來分離不同分子量蛋白質或測定定蛋白質分子量的實驗技術。目前二十七頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點基本步驟制備分離膠制備濃縮膠上樣并電泳凝膠板剝離與染色脫色結果分析目前二十八頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點加入分離膠溶液pH8.8封水出現(xiàn)明顯界面時，分離膠凝聚完成（３０min~１h）倒出水，并用濾紙吸干制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。目前二十九頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點分離膠pH8.8加入濃縮膠溶液pH6.8制備濃縮膠樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳目前三十頁\總數(shù)三十三頁\編于十六點加入電極緩沖液pH8.3濃縮膠pH6.8通電分離膠pH8.8加入樣品上樣及電泳開始電壓恒定在80V，當進入分離膠后改為120V，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。目前三十一頁\總數(shù)三十三頁