體內(nèi)藥物分析

體內(nèi)藥物分析Biopharmaceuticalanalysis第一頁，共六十四頁。第一章體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義狹義：利用現(xiàn)代分析儀器和分離手段對人和動物血液、尿和組織等樣品進(jìn)行定性定量的分析廣義：通過體內(nèi)藥物濃度的分析，了解藥物在體內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量的變化，獲得藥代動力學(xué)參數(shù)，為藥品的生產(chǎn)、臨床應(yīng)用作出評價第二頁，共六十四頁。二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評價和開發(fā)中的意義1．全面質(zhì)量控制2．新藥報批3．為設(shè)計新藥提供信息①從代謝產(chǎn)物中開發(fā)新藥保泰松→羥基保泰松（作用強(qiáng)、副作用?。┓悄俏鞫　鷵錈嵯⑼储谇八幵O(shè)計③新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等以上內(nèi)容必須通過測定體內(nèi)藥物濃度得以解決第三頁，共六十四頁。（二）臨床合理用藥中的意義

1．血藥濃度與藥理作用第四頁，共六十四頁。2.影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素a．生理因素年齡、性別、生理狀況b．病理因素c．遺傳因素（2）藥物因素a．劑型因素（生物利用度問題）b．藥物合并使用（酶抑、酶促）c．時間因素第五頁，共六十四頁。（三）藥物中毒解救的意義（四）興奮劑檢測的意義第六頁，共六十四頁。三、體內(nèi)藥物分析的對象3．從樣品的來源分1．從分析物分母體藥物代謝物內(nèi)源性物質(zhì)2．從生物樣品種類分均勻樣品非均勻樣品人體實驗動物第七頁，共六十四頁。四、體內(nèi)藥物分析的任務(wù)（一）方法學(xué)的研究（二）治療藥物監(jiān)測TDM，therapeuticalDrugMonitoring1．定義2．哪些藥物需進(jìn)行體內(nèi)血藥濃度監(jiān)測第八頁，共六十四頁。①有效血藥濃度范圍窄，稍高毒性大，稍低無療效②劑量小，毒性大的藥物③個體差異大，劑量難以控制④藥物毒性反應(yīng)與疾病癥狀相似⑤多種藥物合并應(yīng)用，有中毒危險⑥胃腸道、肝臟、腎臟疾?、叱史蔷€性動力學(xué)的藥物⑧判斷患者用藥的依從性第九頁，共六十四頁。（三）藥代動力學(xué)的研究（四）代謝分型的應(yīng)用（五）內(nèi)源性物質(zhì)測定

第十頁，共六十四頁。五、體內(nèi)藥物分析的特點1．干擾雜質(zhì)多2．樣品濃度低3．取樣量少4．工作量大5．時間短6．有一定設(shè)備第十一頁，共六十四頁。六、體內(nèi)藥物分析的發(fā)展1．國外發(fā)展概況60年代初 發(fā)現(xiàn)藥效與血藥濃度關(guān)系70年代 體內(nèi)藥物分析方法建立80年代~至今 發(fā)展迅猛，新儀器不斷涌現(xiàn)書籍出版《DrugLevelMonitoring》 1980《TherapeuticalDrugMonitoring》 1981《TextbookofBiopharmaceuticAnalysis》 1981第十二頁，共六十四頁。2．國內(nèi)情況80年代初，藥物分析工作者倡導(dǎo)，1980年版《藥物分析》教材中納入部分內(nèi)容，第二、三版增加體內(nèi)藥物分析一章。第四版、第五版取消，各學(xué)校開設(shè)體內(nèi)藥物分析課程。80年代開始在醫(yī)院進(jìn)行臨床藥學(xué)工作，主要測定藥物濃度。第十三頁，共六十四頁。有關(guān)書籍吳如金《體內(nèi)藥物分析》 人衛(wèi)版 1984陸明廉《血藥濃度測定與臨床應(yīng)用》上?？萍?1986陳剛《治療藥物監(jiān)測理論與實踐》人民軍醫(yī) 1988吳萊文《治療藥物監(jiān)測》 人衛(wèi)版 1989曾經(jīng)澤《生物藥物分析》 北京大學(xué)出版社1998姚彤煒《體內(nèi)藥物分析》 浙大 2001張君仁《體內(nèi)藥物分析》 化學(xué)工業(yè)出版社 2002第十四頁，共六十四頁。3．學(xué)科前沿游離藥物濃度測定直接進(jìn)樣方法研究代謝物測定對映體分析第十五頁，共六十四頁。第二章體內(nèi)藥物存在的狀態(tài)與

體內(nèi)藥物分析的關(guān)系一、藥物的體內(nèi)變化吸收→分布→代謝→排泄ADME過程發(fā)生兩種變化物理變化可逆變化化學(xué)變化結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生變化第十六頁，共六十四頁。二、藥物與血漿蛋白的結(jié)合1．游離型藥物與結(jié)合型藥物（非特異性的結(jié)合）①在血漿、組織中均存在游離型和結(jié)合型的藥物②尿液中含微量P，血漿中含大量P，唾液中P為血漿1/10③與藥物結(jié)合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂蛋白弱酸性藥物主要與白蛋白結(jié)合弱堿性藥物與白蛋白、a1-酸性糖蛋白結(jié)合④藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合通過共價鍵（氫鍵，離子間靜電力等）第十七頁，共六十四頁。2．血漿蛋白結(jié)合率Df+PDbK=解離常數(shù)血漿蛋白結(jié)合率：Β==[P]·[Df]DbDbDb+Df11+K/np+Df/np第十八頁，共六十四頁。結(jié)合力強(qiáng)的藥物可以置換結(jié)合力弱的藥物，通過競爭蛋白是藥物相互作用類型之一。由此可見，K、np是影響β的重要因素np↓β↓K↓β↑藥物在足夠高濃度時使結(jié)合部位飽和，濃度再增高，多余的藥物均呈游離狀態(tài)，結(jié)合部分比率降低，藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥代動力學(xué)的重要參數(shù)之一。第十九頁，共六十四頁。3．血漿蛋白結(jié)合的測定平衡透析法、超濾法、凝膠過濾法、光譜法等。（1）平衡透析法①原理②計算β=×100%=Ct-Cf/Ct×100%袋內(nèi)-袋外袋內(nèi)藥物第二十頁，共六十四頁。③注意事項a.蛋白質(zhì)溶液新鮮血漿pH7.4，至少三個濃度測定b.緩沖液0.13mol/L磷酸鹽緩沖液，因為Na3PO4抑制酸性藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合c.溫度與平衡時間37℃16~48h注意防腐劑加入，藥物的分解d.透析袋滲漏檢測3%三氯醋酸e.攪拌保持動態(tài)平衡第二十一頁，共六十四頁。④影響因素a.藥物膜上吸附b.Donnan效應(yīng)由于電荷的影響，可造成平衡時半透膜兩側(cè)游離藥濃不同，donnan效應(yīng)，加入中性鹽可消除。c.空白值增加d.緩沖液體積變化，水分進(jìn)入血漿游離藥濃↑此法用于測定藥物時，耗費時間太長，一般少采用第二十二頁，共六十四頁。（2）超濾法原理計算注意事項a．裝置50μl→5ml，選擇不同型號超濾膜，保濕。b．速度與時間3000~10000r/min5~15minc．溫度37℃，25℃，4℃影響因素a．膜吸附b．超濾液的體積超濾液/總體積≈0.3~0.6c．超濾膜溫度第二十三頁，共六十四頁。三、藥物與血漿蛋白結(jié)合對體內(nèi)藥物分析的影響1．血漿不同對體內(nèi)藥物分析的影響2．平衡狀態(tài)不同對體內(nèi)藥物分析的影響3．平衡狀態(tài)受破壞對體內(nèi)藥物分析的影響4．游離與結(jié)合同時出現(xiàn)時對體內(nèi)藥物分析的影響第二十四頁，共六十四頁。四、藥物代謝1．研究藥物代謝的意義了解藥物在體內(nèi)的命運及相互作用，保證臨床用藥安全有效研究藥物代謝途徑、藥物結(jié)構(gòu)與藥理作用關(guān)系，尋找新藥研究藥物相互作用機(jī)制有利于建立體內(nèi)藥物分析新方法，避免代謝物干擾第二十五頁，共六十四頁。2．藥物代謝的途徑第一相反應(yīng)：在酶作用下發(fā)生的氧化、還原、水解，使極性增加，水溶性增強(qiáng)第二相反應(yīng)：藥物或經(jīng)一相反應(yīng)后的代謝物與葡萄糖醛酸、硫酸鹽結(jié)合等，使分子極性進(jìn)一步加大，有利于從尿中排出，結(jié)合過程通常使藥物滅活。第二十六頁，共六十四頁。氧化反應(yīng)還原反應(yīng)水解反應(yīng)結(jié)合反應(yīng)a．葡萄糖醛酸結(jié)合b．硫酸酯化c．谷胱甘肽綴合d．乙酰化結(jié)合e．氨基酸結(jié)合第二十七頁，共六十四頁。五、藥物代謝與體內(nèi)藥物分析的關(guān)系1．樣品的保存樣品可能會分解，如血漿酯酶可使酯類藥物水解，酶類可使藥物繼續(xù)代謝，加入酶抑制劑和冷藏保存。2．分析方法選擇光譜法色譜法免疫法3．樣品的提取、分離法代謝物極性大、水溶性強(qiáng)，pH緩沖系統(tǒng)分開尿液中藥物多以結(jié)合型存在，要進(jìn)行水解（酸水解、酶水解，溶劑解）第二十八頁，共六十四頁。第三章生物樣品的預(yù)處理一、生物樣品的采集與貯藏體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。第二十九頁，共六十四頁。（一）樣品的采集1．血樣血樣濃度與作用點的濃度密切相關(guān)，可以反映靶器官的濃度。血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細(xì)胞測定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃抗凝自然全血血液第三十頁，共六十四頁。2．尿樣目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度特點：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分離3．唾液唾液中藥濃與血濃相關(guān)性收集方法離心收集第三十一頁，共六十四頁。（二）樣品的貯藏1．血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏，-70℃加入穩(wěn)定劑NaF2．尿樣①尿中水、無機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長，4℃保存②加入防腐劑a．1%甲苯b．飽和氯仿c．pH改變3．唾液：同血樣第三十二頁，共六十四頁。二、生物樣品的預(yù)處理（一）預(yù)處理的目的①存在形式的多樣性游離結(jié)合代謝物②濃度低，雜質(zhì)多（分離濃縮）③出現(xiàn)渾濁和沉淀④與試劑起反應(yīng)⑤影響色譜柱壽命第三十三頁，共六十四頁。（二）處理方法選擇的一般原則1．藥物理化性質(zhì)pKa親脂性揮發(fā)性溶解度光譜特征穩(wěn)定性2．濃度范圍靈敏的方法3．測定的目的定性定量母體代謝4．生物樣品的種類5．樣品處理與分析方法的選擇①專一性②靈敏性第三十四頁，共六十四頁。（三）生物樣品去蛋白處理1．加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀劑三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白質(zhì)分子的陽離子形成不溶性鹽而↓，pH低于等電點第三十五頁，共六十四頁。3．組織酶消化法加入酶使蛋白質(zhì)水解優(yōu)點：①平衡條件下進(jìn)行，可避免反應(yīng)和降解②可改善對蛋白結(jié)合率強(qiáng)的藥物的回收率③不產(chǎn)生乳化4．其他加熱超濾第三十六頁，共六十四頁。（四）生物樣品綴合物水解1．酸水解2．酶水解β-葡萄糖醛酸苷酶芳基硫酸酯酶混合酶pH4.5-7.037℃3．溶劑解某些藥物的硫酸酯，往往加入率取溶劑時發(fā)生分解，同時提取有機(jī)溶劑中第三十七頁，共六十四頁。（五）生物樣品的萃取1．液-液萃?。?）優(yōu)點：①與雜質(zhì)分離②簡便③濃集④提取率高（2）提取率：在有機(jī)相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對生物樣品一般一次萃取，>70%重現(xiàn)性第三十八頁，共六十四頁。（3）影響提取率的因素①pH堿性藥物在堿性pH酸性酸性pH②提取溶劑相似相溶原理沸點低，不影響檢測,性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng)③離子強(qiáng)度加入中性鹽增加離子強(qiáng)度，與水結(jié)合強(qiáng)，便于有機(jī)溶劑提取第三十九頁，共六十四頁。（4）離子對提取對于離子性特強(qiáng)，水溶性極大的藥物，可采用離子對提?、僭恝趹?yīng)用陰離子：COOH+SO3H-反離子四丁基銨陽離子：NH2+反離子烷基或芳基磺酸鹽（5）提取技術(shù)一般在試管中進(jìn)行有機(jī)相與水相比1:1或2:1第四十頁，共六十四頁。（6）乳化問題措施①輕緩振搖②含有分散度大或不溶物應(yīng)過濾掉③避免在高pH條件下，從水中提取藥物④避免使用易發(fā)生乳化的溶劑⑤萃取劑水中加入少量NaCl第四十一頁，共六十四頁。破孔方法①機(jī)械法②加入少量高級脂肪醇改變表面張力③改善混合溶劑比例，增加分散相分?jǐn)?shù)第四十二頁，共六十四頁。（7）藥物的吸附①玻璃容器吸附1%三甲一氯硅烷10%二甲二氯硅烷②血漿第四十三頁，共六十四頁。2．液固萃取固相萃取[solidphaseextractionSPE]針管式抽空減壓加壓過濾第四十四頁，共六十四頁。（1）固相萃取步驟①固相選擇樣品1ml1ml規(guī)格固相1~25ml3ml規(guī)格固相②固相處理反相C18固定相的6~10倍體積甲醇洗柱，使溶劑化6~10倍水緩沖服液沖洗達(dá)分離狀態(tài)③上樣④分離用適當(dāng)?shù)娜跞軇┫礈煜慈ルs質(zhì)，通N2干燥固相⑤洗脫待測物改變pH或極性第四十五頁，共六十四頁。（2）影響固相萃取的因素（1）流速流速快，按觸不充分，樣品流失回收率低柱處理5~10ml·min-1洗脫0.2~1ml·min-1（〈300mg〉2~5ml·min-1（>300mg）（2）裝樣過載突破性試驗已知濃度樣品液①小體積上柱→洗脫回收百分率②加大體積→洗脫回收百分率③繪圖當(dāng)回收率下降時為過載第四十六頁，共六十四頁。（六）生物樣品的組分濃集（七）衍生化處理GC衍生化HPLC衍生化第四十七頁，共六十四頁。第四章體內(nèi)藥物分析方法的建立與評價一、分析方法靈敏度專屬性光譜法++剛開始應(yīng)用較多雙波長，導(dǎo)數(shù)色譜法++++++HPLCGC免疫法++++++疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性根據(jù)藥物理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥物濃度，干擾成分大小，實驗?zāi)康牡谒氖隧?，共六十四頁。二、分析方法的設(shè)計依據(jù)方法的建立原始方法改進(jìn)→創(chuàng)新創(chuàng)立方法第四十九頁，共六十四頁。1．做好文獻(xiàn)總結(jié)2．充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況3．明確測定目的、要求目的4．結(jié)合實驗室條件

設(shè)備條件

預(yù)處理方法藥濃監(jiān)測藥代動力學(xué)研究母體藥物和代謝物第五十頁，共六十四頁。三、分析方法的建立1．純品進(jìn)行測定確定線性范圍、靈敏度、反應(yīng)條件（pH、t、T）2．空白樣品測定確定空白樣品是否有干擾3．以水代替空白樣品，加標(biāo)準(zhǔn)液后測定了解提取率、檢測濃度確定萃取條件、pH、揮發(fā)濃縮等4．空白樣品加入標(biāo)準(zhǔn)液測定標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

回歸方程

回收率5．實驗樣品測定

第五十一頁，共六十四頁。四、分析方法的評價可行性和可靠性1．準(zhǔn)確度accuracy

測定結(jié)果與真實性的差異用回收率表示

①接近100%②相對恒定第五十二頁，共六十四頁。①絕對回收率也稱萃取回收率、提取回收率測定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液=絕對回收率考慮3個濃度（高、中、低）

分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線成上、中、下一般要求絕對回收率在≥70%一般方法 HPLC內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)法時注意：藥物與內(nèi)標(biāo)用各自外標(biāo)法測定回收率應(yīng)相近，差值<10%第五十三頁，共六十四頁。②相對回收率方法回收率藥物系列濃度+血樣→標(biāo)準(zhǔn)曲線取高、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后測定，與加入標(biāo)準(zhǔn)量相比，得方法回收率，測定值<15%，定量限<20%第五十四頁，共六十四頁。注意問題：a．加入藥量與實際測定值相近b．加入物與實際存在狀態(tài)相近c．空白試驗

與已確定方法進(jìn)行比較第五十五頁，共六十四頁。2．精密度precision

①標(biāo)準(zhǔn)差SD②相對標(biāo)準(zhǔn)性偏差RSD不大于15%，定量限不大于20%②日間精密度 日內(nèi)精密度第五十六頁，共六十四頁。3．靈敏度（sensitivity）

檢測的最小量（1）檢測限（LOD）從背景中檢測到的最小藥物濃度：S/N≥3的絕對量LOD=3N/S（N噪間S被測物信號/單位重量）N=1mm取2μg·ml樣品，20μl進(jìn)樣

峰度30mmLOD=4ng第五十七頁，共六十四頁。（2）定量限(LOQ)在一定精密度和準(zhǔn)確度前提下求得最低檢測量，通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點作為一定量限，也可S/N=10作為定量限，實際測定時，滿足3~5個半衰期濃度，或Cm