顯微鏡的七種觀察方法

關(guān)于顯微鏡的七種觀察方法第1頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月顯微鏡的七種觀察方法第2頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分七種明場(chǎng)暗場(chǎng)熒光偏光相差DIC霍夫曼第3頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月顯微觀察方式第4頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-11.明場(chǎng):照明光直接通過聚光鏡入射于試樣，并透過試樣后進(jìn)入物鏡并最終被觀察到。第5頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月明場(chǎng)第6頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月明場(chǎng)觀察方式常規(guī)觀察方式應(yīng)用領(lǐng)域： 常規(guī)鏡檢、病理、染色標(biāo)本優(yōu)點(diǎn)： 視野亮度高、均勻， 應(yīng)用范圍廣， 操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低， 物鏡適用于熒光觀察缺點(diǎn)： 透明標(biāo)本對(duì)比度低， 標(biāo)本沒有立體感第7頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-22.暗場(chǎng):照明光通過物鏡外圍射于試樣，來自試樣的干涉及衍射光進(jìn)入物鏡并最終被觀察到。第8頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月暗場(chǎng)第9頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理丁道爾(Tyndall)現(xiàn)象，微粒對(duì)斜射光反射或衍射，增大了人眼可見性。2特點(diǎn)觀察到極其微小物體，分辨率可達(dá)0.02~0.004um(明場(chǎng)0.4um)—”超顯微“。3缺點(diǎn)只能觀察到物體存在、運(yùn)動(dòng)和外部形態(tài)不方便調(diào)節(jié)標(biāo)本要求高（灰塵、蓋片、載片）第10頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4應(yīng)用：

微小粒子、細(xì)菌形態(tài)觀察、細(xì)菌記數(shù)，透明標(biāo)本觀察等第11頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-33.熒光:利用某些物質(zhì)在受到了紫外光或短波長(zhǎng)的光激發(fā)照射以后能夠發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光的特性的觀察方法第12頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光第13頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是熒光?

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光第14頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光的種類

自發(fā)（固有）熒光

二次熒光第15頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光的性質(zhì)吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長(zhǎng)＞激發(fā)波長(zhǎng)（損失熱能）熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率第16頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高（放大作用）對(duì)細(xì)胞的刺激?。梢曰铙w染色）能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察——熒光素?zé)晒獾挠袩o、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別——抗體熒光等發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析第17頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光顯微鏡的種類

透射式第18頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡的種類

落射式第19頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡的主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場(chǎng)聚光鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡第20頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月落射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡第21頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月落射熒光顯微鏡的構(gòu)造第22頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡光源

汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G)

氙燈光源：高峰值更寬，更穩(wěn)定第23頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡激發(fā)透鏡組

激發(fā)濾色鏡:

激發(fā)波長(zhǎng)選擇

激發(fā)透鏡組（激發(fā)塊）:

T%nmBANDPASS入射光發(fā)射光激發(fā)濾色鏡分光濾色鏡吸收濾色鏡第24頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月落射熒光顯微鏡各部件特性和作用

吸收濾色鏡:熒光透過,阻擋雜光

分色鏡:反射激發(fā)光,熒光透過＞A透過A＜A反射B＞B透過＜B阻擋nmnmT%T%A第25頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月落射熒光顯微鏡各部件特性和作用

吸收濾色鏡:熒光透過,阻擋雜光

分色鏡:反射激發(fā)光,熒光透過＞A透過A＜A反射B＞B，＜C透過nmnmT%T%AC第26頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收第27頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月帶寬對(duì)圖象的影響SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:BP470-490FITC+PI第28頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月多重染色標(biāo)本的多色觀察FITC+TexasRed+DAPI第29頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月三色濾色鏡的特性曲線激發(fā)分色吸收第30頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI第31頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月單色濾色鏡的特性曲線第32頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月雙色濾色鏡的特性曲線第33頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)行顯微鏡特點(diǎn)和各種濾色鏡第34頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月自由組合激發(fā)塊吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡第35頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月油鏡應(yīng)使用熒光油第36頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

物鏡光欄的運(yùn)用光欄全開啟光欄適當(dāng)關(guān)小減少雜散光干擾第37頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光的衰減

防衰減的方法使用抗衰減劑選擇衰減小的熒光素降低激發(fā)光強(qiáng)度降低標(biāo)本中氧的濃度有衰減的標(biāo)本第38頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月使用抗衰減劑的效果第39頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月汞燈燈箱構(gòu)造燈室，上下、左右旋鈕，聚光鏡旋鈕第40頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-44.偏光:有些物質(zhì)在兩個(gè)呈一定夾角的偏光濾片之間可現(xiàn)呈鮮明的對(duì)比，或根據(jù)雙折射性能和定向呈現(xiàn)顏色第41頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月偏光第42頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理依據(jù)波動(dòng)光學(xué)原理觀察和精密測(cè)定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡自然光（多振動(dòng)面）偏振器1偏振器2偏振光（單一振動(dòng)面）各向同性：?jiǎn)握凵潴w，光性質(zhì)不因照射方向而改變，普通氣體、液體、非結(jié)晶固體等各向異性：雙折射體，光速度、折射率、吸收和振動(dòng)面、振幅隨照射方向不同，晶體、纖維等第43頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用：

礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別鑒別纖維、染色體、淀粉粒、細(xì)胞中晶體植物病理檢驗(yàn)鑒別骨骼、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞、橫紋肌和毛發(fā)等第44頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月偏光顯微鏡主要用于檢測(cè)礦石,地質(zhì)大學(xué)會(huì)用到,特別是可以用來鑒定珠寶,另外可以檢測(cè)生物內(nèi)骨骼,這個(gè)我還沒有遇見實(shí)例,還可以檢測(cè)生物化學(xué)結(jié)晶,化學(xué)院用來觀察結(jié)晶液像,其他在紡織物品化學(xué)成分上檢測(cè)上,物理芯片上等,凡是觀察雙折射晶體會(huì)使用偏光顯微鏡。第45頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-55.相襯（差）:利用光線通過分別處于聚光鏡與物鏡的一對(duì)互補(bǔ)的光環(huán)后產(chǎn)生干涉（強(qiáng)度疊加或減弱），即相位差轉(zhuǎn)變成了光強(qiáng)差，從而可清楚觀察到使原來不易看清的透明類樣品（即相位物體，如活細(xì)胞）。第46頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月相差（襯）第47頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月相差（襯）第48頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理利用被檢物體的光程（折射率x厚度）差進(jìn)行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€，直射光通過補(bǔ)償面：相位推遲，衍射光通過物鏡相板

聚光鏡環(huán)狀光闌第49頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2特點(diǎn)鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法3缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高切片不能太厚(5~10um)蓋片、載片需符合標(biāo)準(zhǔn)最好配用單色濾光鏡操作較麻煩熒光效果不如明場(chǎng)物鏡第50頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4應(yīng)用：

無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，檢查,鑒定活體細(xì)胞(培養(yǎng)細(xì)胞,分離細(xì)胞)第51頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-66.DIC:照明光由微分干涉對(duì)比棱鏡變?yōu)閮墒苌涔?，并使樣品高度差異造成在光路上的微小差異，而光路差異變?yōu)槔梦⒎指缮鎸?duì)比棱鏡和檢偏振器的明暗對(duì)比。有時(shí)也利用敏感色板（波長(zhǎng)補(bǔ)償片），加強(qiáng)了高度差異的顏色變化。第52頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月DIC相襯DIC微分干涉相襯第53頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強(qiáng)度相等的光束，光束載極近的兩點(diǎn)（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。第54頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2特點(diǎn)可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而達(dá)到理想的效果。第55頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月3缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高，雙折射物質(zhì)不能達(dá)到DIC鏡檢效果，不能應(yīng)用于塑料容器培養(yǎng)物的觀察，鏡檢靈敏度有方向性，調(diào)節(jié)較復(fù)雜第56頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月4應(yīng)用：

無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，無色熒光標(biāo)本，染色標(biāo)本，顯微操作等第57頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月按觀察方法分7-77.霍夫曼:光線穿過設(shè)于聚光鏡內(nèi)的狹縫光闌后并經(jīng)“相位物體”（透明體）折射，再經(jīng)過專用物鏡內(nèi)的具有暗、灰、明三個(gè)區(qū)的一塊濾光片，而最終使光線按折射角的不同呈明暗的變化，其所成的像也類似DIC那樣具有浮雕效果。第58頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月霍夫曼第59頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對(duì)比度。第60頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月2.歷史1975年，RobertHoffman博士發(fā)明2002年，專利到期，各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術(shù)產(chǎn)品3.特點(diǎn)提高未染色標(biāo)本的可見性和對(duì)比度；圖象顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會(huì)產(chǎn)生光暈；可檢測(cè)雙折射物質(zhì)(巖石切片、水晶、骨頭)；可檢測(cè)玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細(xì)胞