山西省臨床檢驗中心 裴世靜-新冠病毒核酸檢測質(zhì)量保證

新冠病毒核酸檢測質(zhì)量保證山西省臨床檢驗中心

裴世靜質(zhì)量保證

(Quality

Assurance，QA)：為一產(chǎn)品或服務(wù)滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統(tǒng)的措施。實驗室的布局設(shè)施實驗室的人員生物安全二級實驗室資質(zhì)分區(qū)數(shù)量能力空氣流向環(huán)境3412管理體系文件質(zhì)量管理體系實驗室的設(shè)備各區(qū)的儀器設(shè)備、試劑耗材等生物安全管理體系2檢驗全過程Total

testing

process3分析前分析中分析后l

結(jié)果審核l

結(jié)果報告l

報告?zhèn)鬟fl

結(jié)果保存l

標(biāo)本處理l

檢驗咨詢l

檢驗申請l

患者準(zhǔn)備l

標(biāo)本采集l

標(biāo)本處理l

標(biāo)本運輸l

儀器設(shè)備驗收安裝調(diào)試l

儀器設(shè)備檢定/校準(zhǔn)l

性能驗證/方法確認l

質(zhì)量控制檢測系統(tǒng)Testing

system4npowerenvironmemethodmachinematerial完成一個項目檢驗所涉及的樣本、儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、操作程序、質(zhì)量控制、保養(yǎng)計劃和操作者等的組合稱為檢測系統(tǒng)。Par

t

01

新冠病毒病原學(xué)Par

t

02

設(shè)施設(shè)備管理Par

t

03

試劑耗材管理Par

t

04

實驗室人員管理Par

t

05

質(zhì)量管理體系501/新冠病毒病原學(xué)6冠狀病毒

Coronavirus?

冠狀病毒科冠狀病毒屬?

呈圓形或類圓形?

直徑為80~160納米?

多形性，有包膜，在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)病毒的包膜SARS-CoV電鏡照片

來源上有排列間隔較寬的刺突，類似于日冕。冠狀病毒

Coronavirus病毒顆粒的結(jié)構(gòu)?

刺突糖蛋白（S）?

跨膜糖蛋白（M）?

包膜蛋白（E）?

核衣殼蛋白（N）?

基因組：線性單股正鏈RNA8冠狀病毒

Coronavirus2019新型冠狀病毒

2019-nCoV（一）病原學(xué)特點?

β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形，直徑60~140nm。?

有5個必需基因，分別針對核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基質(zhì)蛋白（M）、刺突蛋白（S）4種結(jié)構(gòu)蛋白及RNA依賴性的RNA聚合酶（RdRp）。?

核蛋白（N）包裹RNA基因組構(gòu)成核衣殼，外面圍繞著病毒包膜（E），病毒包膜包埋有基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）。?

刺突蛋白通過結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE-2）進入細胞。?

體外培養(yǎng)，96小時左右可在人呼吸道上皮細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。?

對紫外線和熱敏感，56℃，30分鐘，乙醚，75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯己定不能有效滅活病毒。2019新型冠狀病毒

2019-nCoV112019新型冠狀病毒

2019-nCoV變異株：世界衛(wèi)生組

織（WHO）定義為“關(guān)注變異株”（Variant

ofInterest，VOI）

和“關(guān)切變異株”(Variant

ofConcern，VOC)。1.關(guān)注變異株：指可導(dǎo)致社區(qū)傳播或聚集性疫情，或在多個國家檢測發(fā)現(xiàn)的病毒變異株。2.關(guān)切變異株：指在監(jiān)測發(fā)現(xiàn)的關(guān)注變異株中，可能會導(dǎo)致

傳播力增強、毒力增加、改變疾病嚴(yán)重程度，或?qū)ΜF(xiàn)有的診斷、治療藥物與疫苗等防治手段帶來影響的病毒變異株。121302/設(shè)施設(shè)備管理14實驗室設(shè)置符合生物安全二級實驗室的要求實驗室分區(qū)及空間大?。嚎蓾M足工作的需求，根據(jù)自己的檢驗項目、所采用的檢測技術(shù)平臺和工作量來決定分區(qū)的多少及各區(qū)域的空間大小。完全的分隔，不存在空氣直通。物品不可混用。空氣流向：單一流向15實驗室分區(qū)設(shè)計的一般原則各區(qū)獨立注意風(fēng)向因地制宜方便工作16實驗室分區(qū)設(shè)計的一般原則四個（實時熒光PCR可三區(qū)）物理上完全分開的各自獨立的區(qū)域，不可為形式上的分區(qū)，不能有通過連通各區(qū)的中央空調(diào)、分區(qū)裝修隔斷不密封、傳遞窗不密封等發(fā)生空氣直通的現(xiàn)象。（中央空調(diào)、吊頂、隔斷、傳遞窗、門窗）。各區(qū)獨立前三區(qū)必須有緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換，也便于更換工作鞋服。防止擴增產(chǎn)物順空氣流進上游擴增前的“潔凈”（無基因、無核酸）區(qū)域?？諝饬飨虬凑赵噭﹥Υ婧蜏?zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)單一流向注意風(fēng)向進行，不得反方向流動。安裝氣壓監(jiān)測表，觀察各區(qū)壓力，各區(qū)間應(yīng)形成5-10Pa的壓差。因地制宜方便工作新建實驗室盡可能合理和規(guī)范，舊的實驗室符合標(biāo)準(zhǔn)即可，具體情況具體分析。人員、物品的流動是否便利、合理；儀器、設(shè)備進出是否方便；消防、安全是否受到影響。17實驗室環(huán)境的基本要求規(guī)范化分區(qū)：?

各區(qū)完全獨立，物品專用，傳遞窗的機械互鎖裝置完好。?

各區(qū)要有明確的標(biāo)記，在各區(qū)或?qū)Ｓ米呃鹊牡孛嫔弦兄甘竟ぷ髁飨虻募^。?

有保證空氣流向的設(shè)施，機械通風(fēng)12~15次/h。?

安裝壓力表，監(jiān)測各區(qū)間的實際壓差。?

使用中央空調(diào)時，各區(qū)有獨立的進風(fēng)和出風(fēng)通道?

各區(qū)操作規(guī)程、記錄表格完整。18實驗室各區(qū)的主要功能和設(shè)備配置（醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則）1234191設(shè)備配置主要功能?

試劑的貯存?????2-8℃和-20℃冰箱混勻器?

試劑分裝微量加樣器（覆蓋0.2-1000ul）可移動紫外燈（近工作臺面）消耗品（一次性手套、一次性吸?

擴增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備?

消耗品的貯存和準(zhǔn)水紙）最為“潔凈”的區(qū)域，不應(yīng)有任何核酸的存在。試劑盒所帶的標(biāo)準(zhǔn)品和陽性對照應(yīng)放在標(biāo)本制備區(qū)。?耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）???專用工作服和工作鞋專用辦公用品專用清潔工具20設(shè)備配置主要功能2?

核酸提取儀?

核酸(RNA、DNA)提取?

擴增反應(yīng)管的制作?

試劑耗材質(zhì)檢?

2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱?

高速臺式冷凍離心機?

混勻器?

標(biāo)本及陰陽相對照、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品保存?

水浴箱或加熱模塊?

微量加樣器（覆蓋0.2-1000ul）?

可移動紫外燈（近工作臺面）?

生物安全柜唯一直接與臨床標(biāo)本接觸的區(qū)域，應(yīng)重視生物安全問題，應(yīng)有洗眼器，配備急救藥箱、標(biāo)本灑溢應(yīng)急處理物品等。?

洗眼器?

消耗品（一次性手套、一次性吸水紙）?

耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）?

專用工作服和工作鞋?

專用辦公用品?

專用清潔用品213主要功能?

cDNA合成、DNA擴增及檢測設(shè)備配置?

核酸擴增儀（配UPS）?

微量加樣器（覆蓋0.2-1000ul）?

可移動紫外燈（近工作臺面）?

消耗品（一次性手套、一次性吸水紙）?

專用工作服和工作鞋要嚴(yán)防擴增產(chǎn)物的“污染”，所有經(jīng)過擴增的反應(yīng)管嚴(yán)禁在此區(qū)域打開。?

專用辦公用品?

專用清潔用品224主要功能?

核酸擴增后產(chǎn)物的分析設(shè)備配置?

微量加樣器（覆蓋0.2-1000ul）?

可移動紫外燈（近工作臺面）?

消耗品（一次性手套、一次性吸水紙）?

耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）?

其他儀器設(shè)備（電泳、雜交等）?

專用工作服和工作鞋本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，注意避免通過本區(qū)物品、鞋服將擴增產(chǎn)物帶出。本區(qū)為負壓，空氣流向由外向內(nèi)。廢液必須收集至1mol/LHCl溶液中，浸泡半小時以上。?專用辦公用品?

專用清潔用品23實驗室各區(qū)主要儀器設(shè)備的規(guī)范使用與管理儀器與設(shè)備儀器、設(shè)備的生產(chǎn)商和供應(yīng)商是否具有國家法律、法規(guī)所規(guī)定的相應(yīng)資質(zhì)。儀器、設(shè)備是否符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，耗材供應(yīng)是否充足、穩(wěn)定。是否建立和實施設(shè)備的評估、確認、維護、校準(zhǔn)和持續(xù)監(jiān)控等管理制度。移液器、溫度計、擴增儀是否有校驗合格證書。擴增儀、離心機、金屬浴、生物安全柜等是否有唯一性標(biāo)簽標(biāo)記。檔案是否有專人管理。檔案內(nèi)容應(yīng)包括：儀器名稱、制造商、序列號、購買日期、使用日期、目前放置地點、設(shè)備驗收、校準(zhǔn)計劃及記錄、維護記錄、使用說明書（原件或復(fù)印件）等。是否建立儀器設(shè)備的管理程序文件：包括儀器設(shè)備使用的的程序文件；儀器設(shè)備的驗收、報廢相應(yīng)程序文件；儀器設(shè)備日常保養(yǎng)、維護程序文件；儀器設(shè)備校準(zhǔn)的程序文件；儀器設(shè)備的狀態(tài)標(biāo)識程序文件等。是否規(guī)定儀器設(shè)備的維護和校準(zhǔn)周期。儀器設(shè)備是否有確認、使用、維護、校準(zhǔn)記錄。是否對樣本核酸擴增檢測過程中的關(guān)鍵儀器、設(shè)備設(shè)置不間斷電力供應(yīng)(UPS)并定期維護。24實驗室各區(qū)主要儀器設(shè)備的規(guī)范使用與管理儀器設(shè)備檢定/校準(zhǔn)國家對于醫(yī)學(xué)計量的要求《中華人民共和國計量法》《中華人民共和國依法管理的計量器具目錄》國家認可委的要求CNAS-CL02《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和認可準(zhǔn)則》（ISO15189）醫(yī)學(xué)檢驗的行業(yè)要求《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》25實驗室各區(qū)主要儀器設(shè)備的規(guī)范使用與管理主要儀器設(shè)備的年度校驗?

加樣器?

溫度計?

濕度計?

擴增儀?

恒溫干浴儀或水浴箱?

離心機?

生物安全柜26實驗室各區(qū)主要儀器設(shè)備的規(guī)范使用與管理儀器設(shè)備檔案

（一機一檔，專人負責(zé)）1.

儀器信息：名稱、型號、序列號、制造商、責(zé)任人、工程師2.

購置資料：可行性方案論證報告、購買申請報告、審批文件3.

技術(shù)資料：出廠合格證書、使用維護手冊、參數(shù)手冊等4.

操作說明書：英文、中文5.

驗收調(diào)試報告：安裝驗收單、調(diào)試報告、驗收報告等6.

使用資料：運行、保養(yǎng)、校準(zhǔn)、維護、維修記錄等27實驗室各區(qū)主要儀器設(shè)備的規(guī)范使用與管理儀器的標(biāo)識實驗室儀器設(shè)備應(yīng)有明顯的唯一標(biāo)識標(biāo)識儀器的狀態(tài)，標(biāo)明儀器的校準(zhǔn)或驗證狀態(tài)，并標(biāo)明再次校準(zhǔn)或再次驗證的日期。?

儀器標(biāo)識編號的原則：?

A類：所有直接用于檢驗分析的儀器設(shè)備；?

B類：冰箱、水浴箱及烤箱等；?

C類：計算機；?

D類：顯微鏡、離心機等儀器設(shè)備。?

標(biāo)識顏色：“合格”（綠色）、“準(zhǔn)用”（黃色）、“停用”（紅色）——《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗室管理與認可實踐（第2版）》叢玉隆、王成彬等28實驗室各區(qū)主要儀器設(shè)備的規(guī)范使用與管理29實驗室各區(qū)主要儀器設(shè)備的規(guī)范使用與管理核酸提取儀PCR擴增儀30生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗實驗室應(yīng)正確合理使用、維護及校驗生物安全柜。衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T442-2014臨床實驗室生物安全指南

附錄C?

工作前需要準(zhǔn)備的內(nèi)容??

工作時的操作規(guī)范及注意事項??

實驗操作結(jié)束后的要求是什么？?

如何保持生物安全柜的潔凈？31生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗基本概念?

氣溶膠：懸浮于氣體介質(zhì)中的粒徑一般為0.001μm～100μm的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的相對穩(wěn)定的分散體系。?

生物安全柜

：具備氣流控制及空氣過濾裝置的操作柜，可有效降低實驗過程中中產(chǎn)生的有害氣溶膠對操作者

和環(huán)境的危害。?

高效空氣過濾器（HEPA濾器）：

一種一次性使用，框架內(nèi)有多重褶迭的干性過濾材料的過濾

器

，

對

0

.

3

微

米

氣

溶

膠

的

過

濾

效

能

達

到99.97%。生物安全柜將經(jīng)HEPA過濾的空氣輸送到工作臺面上，從而保護工作臺面上的物品不受污染。32生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗生物安全柜的分類33生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗基本工作原理?

生物安全柜的工作原理主要是將柜內(nèi)空氣向外抽吸，使柜內(nèi)保持負壓狀態(tài)、安全柜內(nèi)的氣體不能外泄從而保護工作人員；房間空氣?

外界空氣經(jīng)高效空氣過濾器過濾后進入安全柜內(nèi)，以避免處理樣品被污染；經(jīng)過濾器過濾空氣污染空氣?

柜內(nèi)的空氣也需經(jīng)過高效空氣過濾器過濾后再排放到大氣中以保護環(huán)境。Ⅱ級B2型生物安全柜氣流示意圖34生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗生物安全柜的擺放擺放要求五個遠離點（氣流）?

穩(wěn)固的平臺或支架?

兩側(cè)、后面和上端留30cm×

門

×

風(fēng)扇（進風(fēng)口）

×

空調(diào)×

開著的窗戶×

人員活動頻繁的區(qū)域設(shè)備工

作

臺候選位置首選位置設(shè)備35生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗生物安全柜規(guī)范使用要點操作前的準(zhǔn)備?

檢查生物安全柜的相關(guān)指標(biāo)，如風(fēng)速、氣流量和負壓等，這些指標(biāo)均應(yīng)在正常范圍內(nèi)。?

開始工作之前，要準(zhǔn)備一張實驗室工作所需要的材料清單，先將工作所需物品放入，避免雙臂在操作中頻繁橫向穿過氣幕而破壞氣流。?

放入生物安全柜的物品表面應(yīng)用70％乙醇進行消毒，以去除污染。?

打開風(fēng)機5min~10min，待安全柜內(nèi)的空氣得到凈化并且氣流穩(wěn)定后再開始操作。?

生物安全柜上裝有窗式報警器和氣流報警器兩種警報器。當(dāng)窗式報警器發(fā)出警報時，表明操作者將滑動窗移到了不當(dāng)?shù)奈恢?，?yīng)將滑動窗移到適宜的位置；當(dāng)氣流報警器報警時，表明安全柜的正常氣流模式受到了干擾，操作者或物品處于危險狀態(tài)，應(yīng)立即停止工作，通知實驗室主管，并采取相應(yīng)的處理措施。36生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗生物安全柜內(nèi)物品的擺放生物安全柜內(nèi)盡量少放儀器和物品，只擺放本次工作需要的物品。?

所有物品應(yīng)盡量放在工作臺后面靠近工清潔區(qū)半污染區(qū)污染區(qū)作臺后緣的位置，尤其是容易產(chǎn)生氣溶膠的儀器，如離心機、漩渦振蕩器等，應(yīng)盡量往安全柜后面放置，但不可阻塞后面氣口處的空氣流通。?

前面的柵格不要擋住，以免干擾氣流。?

盛放廢物的容器必須放在安全柜內(nèi)，注意體積不要太大，以免影響氣流。?

潔凈物品和污染物品要分放在不同區(qū)域。37生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗操作規(guī)范?

使用生物安全柜時，必須做好個人防護?

開始操作前，要先調(diào)整好凳子或椅子的高度，以確保操作者的臉部在工作窗口之上。?

雙臂垂直緩慢進入柜內(nèi)，等待至少1min，使安全柜內(nèi)氣流穩(wěn)定后再開始操作。?

所有工作都要在工作臺中央或后部進行（離前窗10cm以外），并且通過觀察窗能夠看見柜內(nèi)的操作。?

操作者不要頻繁移動以及揮動手臂以免破壞定向氣流。?

工作用紙不允許放在生物安全柜內(nèi)，不進行文字工作。?

污染的吸頭、離心管等廢物應(yīng)放于安全柜中盛有消毒液的容器內(nèi)消毒1h以上，方可轉(zhuǎn)入醫(yī)療廢物專用垃圾袋中進行高壓滅菌處理。?

盡量減少操作者背后人員的走動及快速開關(guān)房間的門，以防止對柜內(nèi)氣流造成影響。?

禁止在生物安全柜內(nèi)使用明火。?

操作結(jié)束后，使用適宜的消毒劑（70%乙醇）擦拭生物安全柜內(nèi)的臺面和內(nèi)壁（運行狀態(tài)），注意不要擦拭送風(fēng)濾器的擴散板。?

工作完成后，等待5min完成“凈化”的過程，關(guān)閉前窗，關(guān)燈，關(guān)風(fēng)機，可選擇紫外燈照射30min。38生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗維護保持生物安全柜表面清潔和無污染狀態(tài)?

用70%酒精或者合適的消毒劑擦拭內(nèi)壁和工作臺面；?

如果使用漂白劑等腐蝕性消毒劑后，需要用無菌水再次進行擦拭除去殘余的消毒劑；?

定期抬起工作臺面對其下面的區(qū)域進行清潔；?

消毒后，用玻璃清潔器對前窗玻璃和紫外燈進行清潔。生物安全柜的所有維修工作應(yīng)由相應(yīng)資質(zhì)的專業(yè)人員來進行。在生物安全柜操作中出現(xiàn)的任何故障都應(yīng)該報告，并應(yīng)在再次使用生物安全柜之前進行修理。生物安全柜中如果使用紫外燈，應(yīng)每周進行清潔以除去可能影響其殺菌效果的灰

塵和污垢。在生物安全柜重新性能認證時，要檢查紫外線的強度以確保有適當(dāng)?shù)墓獍l(fā)射量。39生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗維護40生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗校驗在安裝時及以后每隔一定時間，應(yīng)由有資質(zhì)的專業(yè)人員按照生產(chǎn)商的說明對每一臺生物安全柜的整體運行性能進行認證，以檢查其是否符合國家及國際的性能標(biāo)準(zhǔn)。最初購買安裝完畢、年檢、移動、修理生物安全柜防護效果的評估應(yīng)包括：①

安全柜的完整性②

人員、產(chǎn)品及交叉污染保護③

HEPA過濾器的泄漏

④

向下氣流的速度⑤

正面氣流的速度⑦

氣流的煙霧模式⑨

電氣安全⑥

負壓／換氣次數(shù)⑧

警報和互鎖系統(tǒng)⑩

光照度還包括紫外線強度、噪聲水平、震動性、集液槽泄漏、柜體穩(wěn)定性（包括柜體抗翻倒、柜體抗變形、工作臺面抗變形、柜體抗向前傾倒）、溫升、電機與風(fēng)機等性能的測試。41生物安全柜的規(guī)范使用、維護與校驗生物安全柜內(nèi)溢灑的處理?

如果溢灑的量不足1mL時，可直接用消毒劑浸濕的紙巾（或其他材料）擦拭。?

如溢灑量大或容器破碎，宜按如下操作：a)

使生物安全柜保持開啟狀態(tài)，等待至少5min。b)

在溢灑物上覆蓋浸有消毒劑的吸收材料，作用至少20min以發(fā)揮消毒作用。c)

在安全柜內(nèi)對所戴手套消毒后，脫下手套。如果防護服已被污染，脫掉所污染的防護服后，用

適當(dāng)?shù)南緞┣逑幢┞恫课?。d)

小心將吸收了溢灑物的紙巾（或其他吸收材料）連同溢灑物收集到專用的收集袋或容器中，并

反復(fù)用新的紙巾（或其他吸收材料）將剩余物質(zhì)吸凈；破碎的玻璃或其他銳器要用鑷子或鉗子

處理。e)

用消毒劑擦拭或噴灑安全柜內(nèi)壁、工作表面以及前視窗的內(nèi)側(cè)；作用一定時間后，用潔凈水擦干凈消毒劑。f)

如果需要浸泡接液槽，在清理接液槽前要先報告主管人員；可能需要用其他方式消毒后再進行清理。?

如果溢灑物流入生物安全柜內(nèi)部，需要評估后采取適用的措施。42核酸提取儀的規(guī)范使用核酸提取的原理ü

核酸提取的基本思路：利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異提取DNA、RNA，去除其他成分。ü

核酸提取的基本原則：保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；排除其他分子的污染。ü

核酸提取應(yīng)達到的要求：核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；其他生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；排除其他核酸分子的污染。ü

核酸提取的注意事項：盡量簡化操作步驟，縮短提取過程；減少化學(xué)因素對核酸的降解；減少物理因素對核酸的降解（機械剪切力和高溫）；減少核酸的生物降解。ü

核酸提取的步驟：破碎、提取、純化。43核酸提取儀的規(guī)范使用核酸提取的原理柱提取法柱提取法利用核酸表面覆蓋一層由水分子構(gòu)成的薄膜，在高鹽環(huán)境下，這層親水膜會遭到破壞，從而核酸可被吸附在離心柱上，而其他雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等則會被離心沉淀與核酸分離。最后通過洗脫，將核酸從吸附膜上脫離，即可得到純化后的核酸。核酸提取儀的規(guī)范使用核酸提取的原理磁珠法攜帶正電荷的磁珠易于吸附負電荷的核酸，主要用于從人血清或血漿樣品中提取DNA和RNA（例如從血液樣本中檢測HIV或HBV病毒基因組的樣品制備）。一般而言，將樣品與結(jié)合緩沖液和磁珠混合，核酸與磁珠結(jié)合后，經(jīng)過數(shù)次洗滌與磁場捕獲，洗脫下來即得到純化的核酸。5核酸提取儀的規(guī)范使用核酸提取的原理自動化儀器磁珠法46核酸提取儀的規(guī)范使用自動化提取儀（磁珠提取法）核酸提取的方法與標(biāo)本保存液和滅活方式相關(guān)，注意提取試劑與提取儀的匹配性。注意事項：ü

不同的提取儀器和試劑的提取效率可能存在差異，請一定嚴(yán)格按照提取試劑盒的說明書進行核酸提取操作。ü

要做好生物安全防護及樣本的防污染保護。ü

提取后及時用75%酒精清潔及紫外燈照射消毒。ü

核酸提取試劑和耗材不得存放于標(biāo)本制備區(qū)。47實時熒光PCR儀的規(guī)范使用、維護與校驗實時熒光定量PCR（Real-timePCR）技術(shù)：1996年由美國ABI公司推出，是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用對熒光信號積累的實時檢測來監(jiān)測整個PCR進程，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。TaqMan實時熒光PCR的基本原理：TaqMan

探針?

5′端標(biāo)記有報告基團(Reporter,

R)，如FAM、VIC等

；?

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團

(Quencher,

Q)?

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收

，無熒光。?

Taq-DNA聚合酶有

5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針，R與Q分開，發(fā)出熒光。PCR儀實時檢測熒光信號，根據(jù)熒光信號與擴增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系，得到擴增曲線。48實時熒光PCR儀的規(guī)范使用、維護與校驗核酸模板加入在生物安全柜內(nèi)，逐一將樣本核酸加入到對應(yīng)的反應(yīng)管中，并加蓋密閉好PCR反應(yīng)管；每批次檢測需要做1個陽性對照和3個陰性對照。PCR檢測管加蓋時建議更換新的手套，防止之前的操作接觸核酸帶入污染的風(fēng)險。上機檢測在擴增區(qū)，從傳遞窗取出配制好的反應(yīng)管，混勻、離心后，小心上機檢測，按照試劑盒說明書設(shè)置擴增參數(shù)并分析判讀結(jié)果。檢測結(jié)束后，為防止可能的擴增污染，擴增結(jié)束后的PCR管嚴(yán)禁開蓋，直接放于封口袋中，封好袋口，不可高壓，按一般醫(yī)療廢物轉(zhuǎn)移出實驗室處理。49實時熒光PCR儀的規(guī)范使用、維護與校驗實時熒光PCR儀的規(guī)范使用配備UPS使用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程維護與校驗的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程有儀器設(shè)備標(biāo)識有儀器設(shè)備簡易操作卡50實時熒光PCR儀的規(guī)范使用、維護與校驗更換燈泡光源維護?

使用無粉手套!?

做好安全防護!51實時熒光PCR儀的規(guī)范使用、維護與校驗用移液器吸取少量無水乙醇滴入污染的孔中吹打數(shù)次，

吸出廢液，重復(fù)三次，

再用去離子水重復(fù)三次加熱蒸發(fā)殘留液。52實時熒光PCR儀的規(guī)范使用、維護與校驗校準(zhǔn)（由廠商技術(shù)人員完成）53實驗室各區(qū)主要儀器設(shè)備的規(guī)范使用與管理規(guī)范使用、定期維護和校準(zhǔn)儀器使用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程維護和校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程保證儀器正常工作的環(huán)境因素監(jiān)測記錄認真檢查校準(zhǔn)報告的內(nèi)容5403/試劑耗材管理55實驗室各區(qū)主要試劑耗材的規(guī)范使用與管理使用試劑的基本組成與功能細擴增反應(yīng)體系?

特異性引物?

熒光探針?

dNTPs核酸提取試劑細胞保存液?

異硫氰酸胍（是不是滅活型的）?

pH?Tris緩沖液?

Tris鹽酸緩沖液?

異丙醇?

金屬離子Mg

K2+

+?

抗生素?磁性顆粒?

熱啟動Taq酶?

逆轉(zhuǎn)錄酶?

胍鹽（蛋白變性劑）?

內(nèi)標(biāo)片段?

蛋白酶K?DEPC水?

RNA酶抑制劑?

內(nèi)標(biāo)片段?

無水乙醇?

內(nèi)標(biāo)片段56實驗室各區(qū)主要試劑耗材的規(guī)范使用與管理試劑、耗材的選購定性項目試劑定量項目離心管?

經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)的耗材?

是否可以穩(wěn)定供應(yīng)?

咨詢同行加樣槍頭?

EQA的信息57實驗室各區(qū)主要試劑耗材的規(guī)范使用與管理試劑的質(zhì)檢外包裝：廠家名稱、檢測項目、批準(zhǔn)文號、批號和有效期等。外觀內(nèi)包裝：試劑瓶是否有漏液、試劑組份、使用說明書是否齊全。定性項目：方法符合率、檢出限、抗干擾能力、交叉反應(yīng)等。定量項目：正確度、精密度（測量重復(fù)性和中間精密度）、線性區(qū)間、可報告范圍、分析特異性（干擾）、分析靈敏度（空白限、檢出限、定量限）等。新冠核酸：包括但不限于精密度和最低檢測限。性能驗證批質(zhì)檢留樣再測：

3份已檢測過的弱陽性臨床樣本，2份陰性樣本。58性能驗證的時機：性能驗證1.

檢驗程序常規(guī)應(yīng)用前。2.

任何嚴(yán)重影響檢驗程序分析性能的情況發(fā)生后，應(yīng)在檢驗程序重新啟用前對受影響的性能進行驗證。影響檢驗程序分析性能的情況包括但不限于：儀器主要部件故障、儀器搬遷、設(shè)施（如純水系統(tǒng)）和環(huán)境的嚴(yán)重失控等。3.

常規(guī)使用期間，實驗室可基于檢驗程序的穩(wěn)定性，利用日常工作產(chǎn)生的檢驗和質(zhì)控數(shù)據(jù)，定期對檢驗程序的分析性能進行評審，應(yīng)能滿足檢驗結(jié)果預(yù)期用途的要求。現(xiàn)用檢驗程序的任一要素（儀器、試劑、校準(zhǔn)品等）變更，如試劑升級、儀器更新、校準(zhǔn)品溯源性改變等，應(yīng)重新進行驗證。驗證技術(shù)方案：至少應(yīng)包含準(zhǔn)備工作、驗證實驗、數(shù)據(jù)收集處理、結(jié)果判讀四部分內(nèi)容。驗證實驗記錄：檢測結(jié)果、質(zhì)控結(jié)果、數(shù)據(jù)分析。驗證報告：是否滿足適宜的檢驗程序分析性能標(biāo)準(zhǔn)（制造商聲明的標(biāo)準(zhǔn)、國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等）。59-------WS/T492-2016臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證60------國家臨檢中心

李金明主任2021年7月山西PCR培訓(xùn)61實驗室各區(qū)主要試劑耗材的規(guī)范使用與管理耗材的質(zhì)檢外觀性能包裝完整性、有效期、畸形、破損

等。通過實驗判斷離心管：煮沸爆管、高速離心漏液等。吸頭：堵塞、漏氣、濾芯污染等。抑制物和污染物：留樣再測或檢測質(zhì)控物。62離心管的質(zhì)檢：煮沸爆管、離心漏液、抑制物隨機抽5個離12000rpm離與預(yù)期結(jié)果一致性隨機抽取20個離心管加半量體積鹽水,100℃，10分鐘觀察有無爆管心管做平行對照實驗（覆蓋檢測范圍）心10分

鐘觀察漏

液和爆管情況63吸頭的質(zhì)檢：堵塞、漏氣、抑制物吸頭（帶濾芯）64新冠病毒核酸檢測（RT-PCR）檢測系統(tǒng)應(yīng)選用擴增檢測試劑盒指定的核酸提取試劑和擴增儀，應(yīng)對由提取試劑、提取儀、擴增試劑、擴增儀等組成檢測系統(tǒng)進行必要的性能驗證。提取試劑盒擴增儀核酸提取儀擴增試劑盒04/實驗室人員管理66人員資質(zhì)人員數(shù)量、人員儲備實驗室負責(zé)人至少具有中級專業(yè)技術(shù)職稱、醫(yī)學(xué)檢驗或相關(guān)專業(yè)背景，有從事分子診斷工作的經(jīng)歷。實驗室操作人員具備相關(guān)資質(zhì)并經(jīng)過有資質(zhì)的培訓(xùn)機構(gòu)培訓(xùn)合格取得上崗證后方可上崗。67人員管理與培訓(xùn)人員管理人員培訓(xùn)至少配備3名專職從事PCR實驗的工作人員。應(yīng)建立分子診斷技術(shù)人員相關(guān)的教育背景、專業(yè)資格、培訓(xùn)、經(jīng)歷及能力記錄檔案，一人一檔，定期更新：?

專業(yè)知識?

實驗技能?

生物安全的培訓(xùn)?

證書復(fù)印件（職稱、崗位）?

教育或以前的工作資料?

職務(wù)說明?

繼續(xù)教育記錄6805/質(zhì)量管理體系69檢驗科如何向臨床醫(yī)師或患者提供高質(zhì)量、準(zhǔn)確、可靠、及時的檢驗報告？建立質(zhì)量管理體系文件建立質(zhì)量管理體系建立質(zhì)量管理體系并使之有效運行是實驗室質(zhì)量管理的主要任務(wù)，就是要將在實驗室檢測中各個環(huán)節(jié)要做的事以文件化的形式表述出來，形成質(zhì)量管理體系文件。70質(zhì)量管理體系文件的構(gòu)成第一層次：質(zhì)量手冊，綱領(lǐng)性的文件，整個實驗室使用的。質(zhì)量手冊11第二層次：程序性文件，支持文件，實驗室各部門使用的。程序性文件22第三層次：作業(yè)指導(dǎo)書，支持文件，具體工作人員使用的、詳細的操作文件。作業(yè)指導(dǎo)書（標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，SOP

）334第四層次：表格、記錄，證實監(jiān)督文件，是質(zhì)量體系有效運行的證實性材料。各種記錄、表格47172程序文件和作業(yè)指導(dǎo)書（SOP）程序文件則是對通用于整個實驗室的某些方面工作的文件化描述，主要包括實驗室文件和檔案等的管理、內(nèi)審、管理評審、合同評審、預(yù)防措施、糾正措施、人員培訓(xùn)、投訴處理、保密、計算機安全、新項目開展、量值溯源、試劑儀器及實驗用品的購買、標(biāo)本管理、廢物處理等方面。SOP最為具體，最具有可操作性，也是使用頻率最高的文件，與實驗室的日常工作密切相