上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓(xùn)班 分子病理技術(shù)及質(zhì)量控制 3.24何妙俠

分子病理檢測(cè)技術(shù)及其質(zhì)量控制Pathological

change第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院病理科何妙俠主講內(nèi)容分子病理的發(fā)展常用分子病理技術(shù)PCR檢測(cè)技術(shù)的質(zhì)控主講內(nèi)容分子病理的發(fā)展常用分子病理技術(shù)PCR檢測(cè)技術(shù)的質(zhì)控DNA的發(fā)現(xiàn)分子病理學(xué)免疫病理學(xué)免疫學(xué)和標(biāo)記技術(shù)超微病理學(xué)細(xì)胞病理學(xué)電鏡1858-AD體液器官病理學(xué)460-377-BC分子病理時(shí)代是必然趨勢(shì)組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)IHC/ICC原位雜交技術(shù)基于PCR技術(shù)的檢測(cè)大體檢查現(xiàn)代病理學(xué)診斷形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子診斷的綜合性診斷靶向藥物要求對(duì)腫瘤進(jìn)行分子分型組織學(xué)驅(qū)動(dòng)性突變NSCLC

的分群治療Non-squamousSquamousSquamousSquamousAdenocarcinoma2010EGFR

MuEGFR

WTNCCN2012Squamous-cellcarcinomaOthernon-squamousWTEGFR

Mu

ALK+

KRAS

MuNCCNNo

mutation

detectedKRAS

(22%)EGFR(17%)EML4-ALK

(4-7%)Double

mutants

(3%)RETMEK1Large

cell

carcinomaMET

AMPHER2PIK3CANCCNGuidelines

Version

2.2013

of

Non-Small

Cell

LungCancerHorn

L,PaoW.

J

Clin

Oncol.2009;26:4232–4235.BRAF(2%)ROS1部分常規(guī)靶向治療預(yù)測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)項(xiàng)目靶向治療靶點(diǎn)腫瘤類(lèi)型antibodiesTrastuzumabRituximab乳腺癌（BC）B細(xì)胞淋巴瘤HER-2CD20結(jié)直腸癌（CRC）CetuximabBevacizumabPanitumumabsmall

moleculeinhibitorsImatinibEGFR/KRASVEGFBreastCa/CRC/非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）EGFRCRCc-kit/

BCR-ABLEGFRGIST/CML肺癌GefitinibErlotinibEGFRNSCLC/胰腺癌LapatinibHer-2

&EGFRVEGFRs/

PDGFR/RAFVEGFRs/

PDGFR/RETBC肝細(xì)胞肝癌（HCC）/腎細(xì)胞癌（RCC）SorafenibSunitinibRCC

&GISTTensirulimus/EverolimusBortezomibmTORRCC多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤Proteasome皮膚T細(xì)胞淋巴瘤VorinostatBortezomibHDACQuek,Yan,Yong

and

Salto-Tellez.Personalized

Medicine（2009）

6(5),465-468分子病理學(xué)開(kāi)啟個(gè)體化治療新時(shí)代的金鑰匙Pathological

change分子病理時(shí)代主講內(nèi)容分子病理的發(fā)展常用分子病理技術(shù)PCR檢測(cè)技術(shù)的質(zhì)控常用分子病理檢測(cè)技術(shù)

免疫組化

原位雜交

PCR擴(kuò)增常用分子病理檢測(cè)技術(shù)

免疫組化

原位雜交

PCR擴(kuò)增常用分子病理檢測(cè)技術(shù)

免疫組化

組織適當(dāng)固定

切片的質(zhì)量

抗原修復(fù)

去除非特異性背景

抗體的質(zhì)量與稀釋

孵育時(shí)間

充分洗滌

適當(dāng)顯色

設(shè)立陽(yáng)性與陰性對(duì)照

正確判讀結(jié)果ERcerbB2常用分子病理檢測(cè)技術(shù)

免疫組化原位雜交PCR擴(kuò)增石蠟包埋組織FISH檢測(cè)

3-5μm切片

涂膠白片

取材位置

乳腺Ca:EBC優(yōu)選原位癌/MBC優(yōu)選轉(zhuǎn)移灶活檢樣本

胃Ca：手術(shù)切除標(biāo)本（6-8個(gè)高質(zhì)量、有代表性的樣本最為理想）FISH第一天操作流程1、從石蠟包埋的癌組織中獲取多塊4μm切片，分別置于涂膠白片上2、將玻片置于65℃烤箱內(nèi)烘烤2小時(shí)以上3、將玻片浸入二甲苯中脫蠟各2次，每次10分鐘4、將玻片浸入100%乙醇中5分鐘5、將玻片依次浸入100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各3分鐘復(fù)水6、將玻片浸入去離子水（pH=7.0-7.2）中5分鐘7、將玻片浸入放有去離子水的考普林瓶中，95℃水浴25分鐘8、取0.4ml蛋白酶K儲(chǔ)存液（20mg/ml）溶于40ml

2×SSC(pH7.0-7.2)得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)FISH第一天操作流程9、將玻片浸入蛋白酶K工作液中，37℃下消化10分鐘10、玻片經(jīng)蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗1次，10分鐘11、將漂洗完的玻片浸入含2.5%甲醛的PBS緩沖液中10分鐘12、將玻片依次浸入70%乙醇和100%乙醇中各3分鐘脫水13、自然干燥玻片14、將8μl雜交緩沖液和2μl探針加入到EP管中15、將10μl的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域即加蓋玻片，用封片膠封邊16、避免蓋玻片與玻片之間產(chǎn)生氣泡，待封片膠干燥后，檢查有無(wú)封嚴(yán)17、將玻片置于82℃的熱臺(tái)上，變性8分鐘18、變性完之后，將玻片移至濕盒中，42℃保溫過(guò)夜，待第二天洗片F(xiàn)ISH第二天操作流程1、去掉封片膠，移去蓋玻片，立即將玻片浸入46℃水浴鍋中的2×SSC溶液中，晃動(dòng)玻片3秒鐘，5分鐘后取出玻片2、將玻片浸入46℃水浴鍋中盛有2×SSC/50%甲酰胺溶液的瓶中，晃動(dòng)玻片3秒鐘，4分鐘后取出玻片3、再將玻片浸入另一瓶46℃水浴鍋中的2×SSC溶液中漂洗1次,3分鐘后取出玻片4、將玻片浸入在70%乙醇和100%乙醇中各3分鐘后取出玻片5、暗處自然干燥玻片6、將10μlDAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片7、置暗處10-20分鐘后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾波片觀察FISH實(shí)驗(yàn)主要存在問(wèn)題

脫蠟不完全徹底

抗原修復(fù)不徹底

消化控制不良

背景緩沖試劑配置沒(méi)到中性

雜交變性溫度及過(guò)夜?jié)穸炔磺‘?dāng)

洗片不到位

結(jié)果判斷不標(biāo)準(zhǔn)43/F

乳腺癌IHCC-erbB-2

+++FISH

陽(yáng)性HER-2

成簇?cái)U(kuò)增

重疊的細(xì)胞，盡量回避，不去計(jì)數(shù)。

若癌區(qū)很少，不得不計(jì)數(shù)時(shí)，重疊區(qū)域內(nèi)的信號(hào)只計(jì)數(shù)一次。

兩信號(hào)點(diǎn)中還能加入一個(gè)相同大小的信號(hào)點(diǎn)，判讀為2個(gè)信號(hào)點(diǎn)

兩信號(hào)點(diǎn)中無(wú)法加入一個(gè)相同大小的信號(hào)點(diǎn)，判讀為分裂型的1個(gè)信號(hào)點(diǎn)

信號(hào)點(diǎn)呈條帶狀，只要中間不斷開(kāi)，判讀為1個(gè)信號(hào)點(diǎn)。常用分子病理檢測(cè)技術(shù)

免疫組化

原位雜交PCR擴(kuò)增常用分子病理檢測(cè)技術(shù)

PCR擴(kuò)增

DNA提取

PCR擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物鑒定石蠟組織DNA的提取?

切

片1

10μm石蠟切片6-10張置于1.5ml

EP管中或貼于干凈載玻片上2

切片時(shí)盡量根據(jù)相應(yīng)蠟塊的形態(tài)學(xué)選取腫瘤組織去掉周?chē)悄[瘤組織

，適當(dāng)烤片?

脫蠟至水1

1200μl二甲苯，混勻，37℃，5min

，9000rpm離心，10min，小心吸棄二甲苯，重復(fù)1-2次2

1200μl無(wú)水乙醇，混勻，9000rpm離心，10min，小心吸棄乙醇，重復(fù)1-2次3

置于37℃EP管開(kāi)蓋，干燥2-3小時(shí)，如用載玻片就常規(guī)脫蠟至水用干凈切片刀刮下組織放入EP管中，同法干燥石蠟組織DNA的提取?

備

注若臨床提供標(biāo)本為外周血或骨髓，均應(yīng)加抗凝劑，低速離心小于1000轉(zhuǎn)/min

離心5min；然后加入淋巴細(xì)胞分離液，常規(guī)分離淋巴細(xì)胞，低速離心15min，吸取淋巴細(xì)胞，再加直接加裂解液和蛋白酶K提取Tiangen基因組DNA抽提試劑盒?

消

化1

加入GA溶液，和蛋白酶

K(20

mg/ml)

20μl2

55℃過(guò)夜，至組織完全透明清澈，其間可根據(jù)組織大小分步適量再加5-10μl蛋白酶K，并間歇震蕩3

加入200ulGB溶液，

70℃震蕩混勻10min，使溶液變清亮，加入200ul無(wú)水乙醇，震蕩混勻?

DNA抽提1

倒入收集管的吸附柱中，12000

rpm,

離心

30s，棄廢液2

吸附柱中加入500ul

GD溶液，12000rpm,

離心

30s，棄廢液3

吸附柱中加入500ul

PW溶液，12000rpm,

離心

30s，棄廢液4

吸附柱中加入500ul

PW溶液，12000rpm,

離心

2min，棄廢液5

12000

rpm,

離心

2min，棄廢液，直至吸附柱管壁上無(wú)水珠T(mén)iangen基因組DNA抽提試劑盒?

DNA洗脫1將吸附膜懸空，滴加50ul

TE洗脫液，室溫靜置5min2

12000rpm,離心

2min，收集洗脫液3將洗脫液反復(fù)加入吸附柱中，靜置5min，12000rpm,離心

2min，收集洗脫液，-20℃冰箱保存?

DNA測(cè)定1

取5μl樣本DNA，以TE緩沖液稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及OD值(260

nm/280nm)2

OD值(260nm/280nm)在1.8~2.0之間為妥3取1μl樣本DNA，用1.5-2%瓊脂糖凝膠電泳4-20℃冰箱保存PCR擴(kuò)增?

PCR反應(yīng)體系模板DNA

2.0

ul(1ug)2×Taq

PCRMasterMix

12.5

ulPrimer

1（10

uM）

1.0ulPrimer

2（10

uM）

1.0ulddH2O5.5ul總體積25.0

ul?

PCR反應(yīng)循環(huán)預(yù)變性

94℃變性

94℃復(fù)性

55℃延伸

72℃充分延伸72℃5min1min45s1min10min35cyclePCR擴(kuò)增?

PCR反應(yīng)完成后處理95℃

5min4℃

1h然后4℃保存?

目

的去除異源雙鏈聚合物去除引物二聚體PCR產(chǎn)物鑒定?

配制TAE電泳緩沖液，一般為0.5%?

配制瓊脂糖凝膠，一般為1.5-2%?

電泳板上鋪膠，注意點(diǎn)樣孔?

點(diǎn)樣，

注意操作瓊脂糖凝?

電泳，

約30分鐘膠

?

注意觀察不能跑出膠外，

達(dá)膠的2/3處即可電

?

紫外燈掃描系統(tǒng)掃描觀察結(jié)果泳

?

成像法?

注意非特異性條帶的干擾?

陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照PCR擴(kuò)增注意事項(xiàng)

PCR擴(kuò)增

組織適當(dāng)固定

徹底脫蠟

完全消化

DNA濃度與質(zhì)量控制

反應(yīng)體系濃度

擴(kuò)增條件

去除非特異性結(jié)合

正確的凝膠電泳

設(shè)立陽(yáng)性與陰性對(duì)照

正確判讀結(jié)果PCR擴(kuò)增技術(shù)延伸

PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增--毛細(xì)管電泳

PCR擴(kuò)增--片段分析與測(cè)序

PCR擴(kuò)增--直接測(cè)序

qPCR-HRM法PCR擴(kuò)增-毛細(xì)管電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增-片段分析與測(cè)序

PCR擴(kuò)增?

片段分析將整個(gè)DNA作為一個(gè)整體進(jìn)行分析?

測(cè)序分析分析DNA序列的堿基順序，是否發(fā)生改變應(yīng)用毛細(xì)管電泳片段分析PCR擴(kuò)增直接測(cè)序的應(yīng)用

適用：點(diǎn)突變小片段缺失插入突變

臨床應(yīng)用：胃腸道間質(zhì)瘤

KIT

PDGFRA突變結(jié)直腸癌

KRAS

BRAF突變?nèi)橄侔?/p>

EGFR

KRAS突變胃腸道間質(zhì)瘤相關(guān)檢測(cè)Real-Time

PCR

擴(kuò)增技術(shù)

Real-Time

PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程定量和定性分析包括

TaqMan法ARMS法

Real-Time

PCR熒光探針?lè)翘禺愋蕴结楽YBR

Green特異性探針TaqMan

探針蝎形探針環(huán)形探針ARMS法結(jié)果判讀主講內(nèi)容分子病理的發(fā)展常用分子病理技術(shù)PCR擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)控分子病理診斷的質(zhì)量控制

專(zhuān)門(mén)的PCR認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室

經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的技術(shù)人員上崗

有資質(zhì)的病理醫(yī)師簽發(fā)報(bào)告

標(biāo)本質(zhì)量過(guò)關(guān)

操作環(huán)節(jié)嚴(yán)格質(zhì)控

結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化PCR擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)量控制標(biāo)本質(zhì)量過(guò)關(guān)

操作環(huán)節(jié)嚴(yán)格質(zhì)控

結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化PCR擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)量控制標(biāo)本質(zhì)量過(guò)關(guān)

穿刺組織

新鮮組織

福爾馬林固定石蠟包埋組織

血液

體液

骨髓液適用于突變檢測(cè)的標(biāo)本建議采用靈敏度RMS檢測(cè)病理評(píng)估合格的標(biāo)本適用基因突變病理學(xué)評(píng)估確認(rèn)腫瘤細(xì)胞數(shù)大于100組織學(xué)觀察標(biāo)本接收、固定組織處理、石蠟包埋切片及H&E染色

標(biāo)本通常較大，能提供足夠的腫瘤組織用于檢測(cè)

標(biāo)本可以是冰凍或福爾馬林固定組織支氣管鏡和細(xì)針穿刺活檢標(biāo)本

標(biāo)本較小

通常是福爾馬林固定、石蠟包埋處理

建議采用靈敏度高的ARMS檢測(cè)方法細(xì)胞學(xué)標(biāo)本涂片、染色液基細(xì)胞學(xué)病理診斷病理診斷病理診斷胸水或支氣管刷片或痰液細(xì)胞蠟塊，切片染色

細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中通常腫瘤細(xì)胞數(shù)目較少，需要采用靈敏度高的ARMS檢測(cè)方法

建議有條件的病理科制備細(xì)胞蠟塊：

處理流程：細(xì)胞學(xué)標(biāo)本經(jīng)離心處理后，常規(guī)福爾馬林固定、處理及石蠟包埋即可

制備細(xì)胞蠟塊的好處：(1)便于長(zhǎng)期保存(2)便于基因突變的檢測(cè)及其他分子生物學(xué)標(biāo)記物的檢測(cè)標(biāo)本的病理評(píng)估內(nèi)容

診斷：確保腫瘤組織是非小細(xì)胞性肺癌（以肺癌為例）

腫瘤組織量：確保有足夠的腫瘤組織用于突變檢測(cè)

盡量保證200-400個(gè)腫瘤細(xì)胞對(duì)于技術(shù)成熟的實(shí)驗(yàn)室，可嘗試進(jìn)行＜200個(gè)腫瘤細(xì)胞標(biāo)本檢測(cè)

5-10uM

10張切片能滿足突變檢測(cè)需求當(dāng)細(xì)胞數(shù)較少時(shí),可以適當(dāng)增加切片數(shù),以滿足檢測(cè)需求

腫瘤比例：標(biāo)識(shí)腫瘤豐富的區(qū)域，提高腫瘤細(xì)胞比例用于檢測(cè)

盡量去除非腫瘤組織及細(xì)胞，提高檢測(cè)的敏感性

不同敏感性的檢測(cè)方法對(duì)腫瘤比例要求不一樣測(cè)序法：＞10%ARMS法：＞1%肺癌的分類(lèi)與基因突變的關(guān)系

貼壁為主型、乳頭為主型、和腺泡為主型腺癌預(yù)后較好，EGFR基因突變率高

K-ras基因突變最常見(jiàn)于浸潤(rùn)性粘液腺癌和實(shí)體為主性腺癌

ALK融合基因最常見(jiàn)于含有印戒細(xì)胞的腺癌，以及腺泡型、乳頭型、篩狀和產(chǎn)生黏液的腺癌PCR擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)量控制

標(biāo)本質(zhì)量過(guò)關(guān)操作環(huán)節(jié)嚴(yán)格質(zhì)控

結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化操作環(huán)節(jié)嚴(yán)格質(zhì)控第一步

DNA提取第二步

加樣上機(jī)第三步

結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照突變信號(hào)不含突變的曲線圖含突變的曲線圖DNA的質(zhì)量控制標(biāo)本質(zhì)量過(guò)關(guān)

切片量適宜

切片時(shí)每個(gè)標(biāo)本間更換刀片

切片時(shí)戴手套

脫蠟徹底干凈

嚴(yán)格控制樣品間交叉污染DNA的質(zhì)量控制常用DNA質(zhì)控方法對(duì)比DNA評(píng)估參數(shù)方法適用DNA來(lái)源全部DNA可擴(kuò)增

DNADNA

純度Spectrophotometry分光光度計(jì)冰凍新鮮組織、全血、細(xì)胞系√X√Fluorimetry(eg.Picogreen)熒光染料冰凍新鮮組織、全血、細(xì)胞系√XXFFPE組織、血漿、血清以及其他來(lái)源高度降解DNAX√qPCRqPCR法定量的優(yōu)點(diǎn)：排除DNA質(zhì)量不符合要求樣品，節(jié)省成本、時(shí)間

分光光度計(jì)（260nm處光密度值）和熒光染料法檢測(cè)總DNA量

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：無(wú)法評(píng)估可擴(kuò)增的DNA片段和PCR抑制劑紫外分光光度計(jì)法

熒光定量PCR只檢測(cè)可擴(kuò)增的DNA片段的量，并評(píng)估是否有PCR抑制劑優(yōu)點(diǎn)：FFPE來(lái)源DNA的最可靠，排除DNA質(zhì)量不符合要求的樣本（節(jié)省成本，時(shí)間）缺點(diǎn)：增加了檢測(cè)所用時(shí)間，增加成本PCR

產(chǎn)物長(zhǎng)度可擴(kuò)增DNADNA

10倍稀釋后加樣操作注意事項(xiàng)正確操作錯(cuò)誤操作槍尖不可伸入到封蓋劑之下槍尖靠在管口伸入5mm處加入樣品設(shè)定閾值閾值線使用軟件自動(dòng)設(shè)定的閾值，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)閾值設(shè)定在背景熒光信號(hào)之上，擴(kuò)增曲線的指數(shù)期之內(nèi)（LOG曲線下，背景熒光與平臺(tái)期兩者中間）設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照

陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)FAM熒光信號(hào)產(chǎn)生

陽(yáng)性對(duì)照FAM和VIC信號(hào)均應(yīng)升起，陽(yáng)性質(zhì)控品的Ct值一般小于20，但可能會(huì)由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動(dòng)設(shè)立樣本外控

待測(cè)樣本的外控應(yīng)有FAM信號(hào)石蠟包埋組織切片樣品，則15

≤

Ct值≤

21非石蠟切片樣品，則13

≤

Ct值≤

19外控Ct值可能原因解決方法石蠟包埋組織樣品，Ct＜15；非石蠟切片樣品，Ct＜13。加入DNA過(guò)量稀釋DNADNA含有抑制劑DNA量加入不夠稀釋或重新抽提DNA增加DNA用量石蠟包埋組織樣品，Ct＞21；非石蠟切片樣品，Ct＞19。設(shè)立樣本內(nèi)控

待測(cè)樣本的內(nèi)控(1-7號(hào)管的HEX信號(hào)曲線)應(yīng)有擴(kuò)增曲線1.

HEX有信號(hào)，F(xiàn)AM無(wú)信號(hào)

——質(zhì)控通過(guò)2.

HEX無(wú)信號(hào)，F(xiàn)AM有信號(hào)

——質(zhì)控通過(guò)3.

任何一管HEX，F(xiàn)AM均無(wú)信號(hào)—質(zhì)控不通過(guò)（該樣品數(shù)據(jù)無(wú)效）可能原因解決方法樣品DNA中存在PCR抑制劑稀釋或重新抽提DNADNA量加入不夠加樣時(shí)漏加DNA增加DNA用量重新檢測(cè)PCR擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)量控制

標(biāo)本質(zhì)量過(guò)關(guān)

操作環(huán)節(jié)嚴(yán)格質(zhì)控結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化

同時(shí)選擇同一號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和樣品的擴(kuò)增曲線

選定閾值線，判讀Ct值陽(yáng)性樣品陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性樣品陰性樣品基因檢測(cè)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)模板

患者基本信息

基因檢測(cè)結(jié)果和結(jié)論

檢測(cè)方法和試劑

被檢標(biāo)本來(lái)源與部位

基本病理學(xué)狀態(tài)；

標(biāo)本種類(lèi)與名稱(chēng)

腫瘤細(xì)胞數(shù)量；腫瘤細(xì)胞數(shù)所占比例等

DNA的質(zhì)控結(jié)果

由病理醫(yī)生簽發(fā)備注：該檢測(cè)結(jié)果僅對(duì)本次送檢標(biāo)本負(fù)責(zé)ARMS法ARMS

突變檢測(cè)稀釋DNA樣品濃度到2-3ng/ul配制樣品DN