熒光光譜儀原理及其使用方法詳解演示文稿

熒光光譜儀原理及其使用方法詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)（優(yōu)選）熒光光譜儀原理及其使用方法目前二頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)不同類型的發(fā)光最普通的是熒光.如果當(dāng)一個物質(zhì)吸收一定波長的光然后給出較長波長的光稱為熒光.一些油漆、紙張具有熒光特性.其次是磷光.當(dāng)一種物質(zhì)吸收光，然后再發(fā)出光稱為磷光.如果磷光物質(zhì)暴露在陽光下，然后再帶到暗室內(nèi),給出的光稱為磷光.化學(xué)發(fā)光：當(dāng)2種化學(xué)物質(zhì)混合后給出的光.螢火蟲發(fā)光是一種生物發(fā)光.螢火蟲會產(chǎn)生.熒光素酶，導(dǎo)致發(fā)光.類似化學(xué)發(fā)光，兩種生物化學(xué)物質(zhì)混合產(chǎn)生光.目前三頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)分子吸收、熒光、磷光輻射躍遷目前四頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)無輻射躍遷——去活化過程

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)。這些過程包括：1）振動弛豫

在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換

對于具有相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動耦合產(chǎn)生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。目前五頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)定性分析任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜改變激發(fā)波長，測量在最強(qiáng)熒光發(fā)射波長處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長對熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因為分子吸收光能的過程就是分子的激發(fā)過程。激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時，用于選擇最適宜的激發(fā)波長。目前六頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)2）發(fā)射光譜發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長和強(qiáng)度的激發(fā)波長輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長的強(qiáng)度的熒光，以熒光強(qiáng)度對其波長作圖可得熒光發(fā)射光譜。由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。萘激發(fā)、熒光、磷光如右圖所示。目前七頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系i）波長比較與激發(fā)（或吸收）波長相比，熒光發(fā)射波長更長，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動弛豫失活所致）ii）形狀比較熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān)。盡管分子受激到可到達(dá)不同能級的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫）到第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達(dá)第一激發(fā)態(tài)一樣。換句話說，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層。目前八頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)iii）鏡像對稱通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系。蒽的熒光光譜和吸收光譜目前九頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)解釋：能層結(jié)構(gòu)相似性熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層而形成，即其形狀與基態(tài)振動能級分布有關(guān)。吸收光譜是由基態(tài)最低振動能層躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個振動能層而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動能級分布有關(guān)。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動能層分布具有相似性，因而呈鏡像對稱。S1S0熒光吸收目前十頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)產(chǎn)生熒光的條件i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率足夠大：發(fā)射的光量子數(shù)=————————吸收的光量子數(shù)

目前十一頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)

1）躍遷類型：具有—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會產(chǎn)生熒光。且具—*躍遷的量子效率比n—*躍遷的要大得多。芳香屬分子2）共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強(qiáng)。平面環(huán)系統(tǒng)，絕大多數(shù)熒光物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)影響熒光及強(qiáng)度的因素目前十二頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)3）剛性結(jié)構(gòu)：分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。如熒光素（大）與酚酞（=0）；芴（=1）與聯(lián)苯（=0.18）。目前十三頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)4）取代基：給電子取代基增強(qiáng)熒光（p-共軛），如-OH、-OR、-NH2、-CN、NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失目前十四頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)5）溶劑效應(yīng)：溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度（改變—*及

n—*

躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)度。6）溫度：溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因為內(nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。7）pH值：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對無機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。8）熒光猝滅：碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅；轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅；電子轉(zhuǎn)移猝滅；自猝滅。目前十五頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)測量過程

提供能量(光源)選擇激發(fā)波長(吸收)照射樣品樣品吸收與發(fā)射熒光(發(fā)射)選擇發(fā)射波長測量目前十六頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)激發(fā)光譜告訴我們什么？

化合物吸收波長吸收強(qiáng)度

溶劑吸收波長目前十七頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)激發(fā)光譜

目前十八頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)發(fā)射光譜告訴我們什么？化合物熒光波長熒光強(qiáng)度拉曼和瑞利散射目前十九頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)發(fā)射光譜

目前二十頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)哪些峰不是樣品峰瑞利散射激發(fā)波長峰發(fā)射和激發(fā)相同波長的峰拉曼散射溶劑發(fā)射波長(documented)與激發(fā)波長相差固定頻率的波長2次或3次光發(fā)生在激發(fā)波長的2倍或3倍波長處目前二十一頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)瑞利散射

顆粒的大小小于入射光的波長.光通過樣品后頻率不變.由于彈性碰撞不存在能量的轉(zhuǎn)移.光線只是簡單地改變方向，波長不變.

粉末、懸浮液等樣品.

目前二十二頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)拉曼散射

樣品吸收和發(fā)射光并伴隨有能量轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生.光通過樣品后光的波長、頻率發(fā)生了改變.與入射光相比發(fā)射光的頻率可能更高或者更低.目前二十三頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)瑞利、拉曼散射和2次光

瑞利散射峰350拉曼峰397↙↙2次光699792↙↓目前二十四頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)外來峰的校正截止濾光片去除2次、3次等高次光差譜法去除拉曼和瑞利散射峰用高純?nèi)軇?無熒光)掃描溶劑確定拉曼峰維持測定溫度與條件目前二十五頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)高通和帶通濾光片套件目前二十六頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)高通濾光片用于去除散射光目前二十七頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)定量目前二十八頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系

If=2.3fI0bc=KCIf=熒光相對強(qiáng)度f=量子效率I0=入射光強(qiáng)度=吸收系數(shù)b=光程長c=濃度該式只有bc<<0.05時才成立，即熒光測定只有在極稀溶液中才可測定，否則校正曲線向濃度軸彎曲。目前二十九頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)表與標(biāo)準(zhǔn)曲線

目前三十頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)

熒光分光光度計原理和結(jié)構(gòu)目前三十一頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)熒光分光光度計示意圖發(fā)射單色器PMPM分束器光源激發(fā)單色器——光閘樣品池目前三十二頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)光源：氙燈、高壓汞燈、激光；樣品池：石英（低熒光材料）；兩個單色器：選擇激發(fā)光單色器；

分離熒光單色器；兩個檢測器：光電倍增管。主要部件目前三十三頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)RF-5301PC光路圖目前三十四頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)儀器性能高水平靈敏度：蒸餾水的拉曼峰S/N比為150以上（EX350nm，狹逢5nm）狹逢10nm拉曼峰S/N＞600目前三十五頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)利用先進(jìn)的直流式長驅(qū)動機(jī)構(gòu)，可及為迅速的得到理想的光譜可進(jìn)行高速光譜監(jiān)控，最高掃描速度５５００ｎｍ／ｍｉｎ波長范圍：220-900nm及0次狹逢：1.5、3、5、10、15、20nm6檔及激發(fā)6nm半高波長精度：±1.5nm

波長掃描速度Survey,Super,VeryFast,Medium,Slow,VerySlow的7段轉(zhuǎn)換；Survey,約5,500nm/min.Super約3,000nm/min.儀器性能目前三十六頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)功能強(qiáng)大、操作簡便的軟件系統(tǒng)功能：激發(fā)光譜、熒光、同時光譜測定

定量分析（１－３次標(biāo)準(zhǔn)曲線）

時間掃描—動力學(xué)

目前三十七頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)只需打開自動檢索最佳激發(fā)光和熒光波長從瑞利散射、拉曼散射及２次光中自動判斷出熒光使復(fù)雜的波長設(shè)置簡單化檢索最佳的激發(fā)光和熒光波長目前三十八頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)四則運(yùn)算數(shù)據(jù)變換（1-4介導(dǎo)數(shù)，倒數(shù)，對數(shù)）曲線平滑峰值檢測面積計算活度值計算等計算平均值多樣的數(shù)據(jù)處理目前三十九頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)擴(kuò)展功能和附件大樣品室可安裝各種樣品池架ＬＣ流動樣品池偏光裝置等目前四十頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)豐富的任選附件：單一恒溫樣品池（帶攪拌器）該部件在恒溫狀態(tài)下攪拌試樣，進(jìn)行測定，最適合浮游細(xì)胞的熒光測定。利用恒溫水的循環(huán)，可使樣品池恒溫化。攪拌器的速度可調(diào)節(jié)恒溫水循環(huán)裝置使用溫度范圍：室溫—850C

溫度調(diào)節(jié)精確度：+0.050C

泵的流量：最大15L/18L/min(50/60Hz)

容器的容量：約6.8L目前四十一頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)恒溫四連池架利用恒溫水的循環(huán)，一次可使4個樣品池恒溫化。適用的溫度范圍：50C--800C微量樣品池裝置取400ul的少量試樣就能測定。試樣可以放入與四面研磨樣品池大?。?0mm)的槽中，安裝在樣品池架上進(jìn)行測定。目前四十二頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)測定偏光的輔助裝置

（用于紫外可見光或只用于可見光）利用熒光偏光度的測定獲得關(guān)于分子的大小、流動性及分子周圍環(huán)境的信息。高靈敏度池架目前四十三頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)固體（粉末）樣品架固體、粉末樣品，甚至樣品池中的溶液也能用反射方式進(jìn)行熒光測定。高臺樣品架目前四十四頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)LC流動樣品池（12ul)用于高速液相色譜分析的高靈敏度分光熒光監(jiān)控。自由選擇激發(fā)光波長和熒光波長，可進(jìn)行有選擇的檢測。LC流動樣品池（120ul)用于分析鄰苯二酚胺。使用內(nèi)容積120ul的散射光少的雙面反射型石英微型的流動樣品池。目前四十五頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)光電倍增管換用光電倍增管，可進(jìn)行900nm以內(nèi)的熒光光譜的測定。直徑8mm的試管架可以安裝試管目前四十六頁\總數(shù)四十八頁\編于十九點(diǎn)熒光應(yīng)用領(lǐng)域—生命科學(xué)氨基酸、縮氨酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、維生素、輔酶、胺類等（1） 定性、定量（2） 研究酶反應(yīng)：分析研究基質(zhì)、輔酶、蛋白質(zhì)（色氨酸、3-對羥基苯基丙氨酸）的反應(yīng)機(jī)理（3） 抗原、抗