《生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第五章 非切片法的制作

第五章非切片法的制作第一節(jié)整體制片法第二節(jié)涂片法*第三節(jié)分離法第四節(jié)鋪片法第五節(jié)滴片法*第六節(jié)壓片法自學(xué)染色：甲基綠、碘液、1%美蘭第一節(jié)整體制片法二、半永久和永久性制片一、臨時(shí)制片第五章1.甘油封片法5%甘油標(biāo)本蒸發(fā)2-3天

載片

怕壓、易碎標(biāo)本：2.甘油膠封片法

避免蒸發(fā)或流動(dòng)：最適合于柔軟易碎材料。材料固定、水洗5%甘油2h10%甘油1h

甘油膠封片石蠟或漆封邊

玻璃絲

（直徑0.2-0.5mm

）第一節(jié)整體制片法第五章3.甘油或甘油膠-樹(shù)膠雙封片法材料要觀察的面朝向大蓋片

蓋玻片載玻片蓋玻片的小片朝下封于載片上

第五章第一節(jié)整體制片法甘油或甘油膠封片中性樹(shù)膠封片4.聚乙烯醇封片法

新鮮和固定的標(biāo)本

小而透明的標(biāo)本用木素粉紅或酸性品紅染色

乳酸和石炭酸等量混合劑配4%、5%、10%

甲殼動(dòng)物、單殖吸蟲(chóng)、寄生線蟲(chóng)、棘頭蟲(chóng)及動(dòng)物中粘孢子

單殖吸蟲(chóng)棘頭蟲(chóng)第五章第一節(jié)整體制片法寄生線蟲(chóng)魚(yú)體表粘孢子蟲(chóng)棘頭蟲(chóng)

30%Alc→40%Alc→50%Alc→60%Alc→70%Alc

→80%Alc→95%

Alc→100%Alc→100%Alc→純酒精/二甲苯2：1→1：1→1：2→純二甲苯（1）原生動(dòng)物(或小型浮游生物)整體封片法材料特點(diǎn)：在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)或制備成的懸液棄培養(yǎng)液各級(jí)酒精脫水、二甲苯透明封片固定液離心離心中性樹(shù)膠棄上清液第一節(jié)整體制片法第五章5.樹(shù)膠封片法

離心機(jī)的轉(zhuǎn)速紐蟲(chóng)肝片吸蟲(chóng)肝片吸蟲(chóng)華枝睪吸蟲(chóng)材料特點(diǎn)：身體扁平如葉片狀，固定時(shí)易卷縮用薄荷冰/水合氯醛于7%生理鹽水麻醉(2)吸蟲(chóng)整體封片第五章第一節(jié)整體制片法70%Alc蟲(chóng)體70%Alc固定2~12h硼砂洋紅液染蟲(chóng)體3~10h70%Alc沖洗常規(guī)脫水、透明、封片濾紙載片第五章第一節(jié)整體制片法(3)瓊脂定位，藪枝蟲(chóng)(或水螅體、卵胚)整體封片水螅材料特點(diǎn)：易收縮、需要定位薄荷冰麻醉10%甲醛固定稀釋的蘇木精/硼砂洋紅染色酸酒精分色用瓊脂定位于載片上常規(guī)脫水、透明、封片第一節(jié)藪枝蟲(chóng)第五章第一節(jié)整體制片法聚縮蟲(chóng)第二節(jié)涂片法

將一些不需切片的動(dòng)植物的組織細(xì)胞或體液組織（如動(dòng)物的血液、精液、骨髓等）用機(jī)械的方法使其均勻地?cái)傇谳d片上，再進(jìn)行固定、染色、觀察。對(duì)玻片要求嚴(yán)格洗液12h~24h流水沖至中性95%Alc第五章重鉻酸鉀20g，蒸餾水40mL，加熱溶解，稍冷，加濃硫酸350mL

一、人血液涂片BloodSmear2.涂片方法：1.取血：第二節(jié)涂片法第五章

注意：滴血后馬上涂片推片速度、角度大小與血膜厚薄有關(guān)一張載片只能涂1次用來(lái)推片的載片邊緣只能用1次①血滴于一端1/3處30-40°用力均勻、勻速血涂片自然晾干②③④⑤（1）Wright染色法:（2）Giemsa染色法瑞氏粉含曙紅和亞甲藍(lán)吉氏粉含曙紅和天青對(duì)酸堿敏感！天青加熱會(huì)消失！第二節(jié)涂片法第五章3.染色瑞士粉0.1g，甲醇50mL，充分溶解。將染色液滴加到血膜上，染1~3min，再滴加等量蒸流水染2~8min，蒸餾水沖洗，干燥后封片吉士粉0.38g，甘油12.5mL，甲醇37.5mL。甲醇和甘油60℃，配制成吉姆薩原液。使用時(shí)0.3mL加蒸餾水10mL。血液涂片用甲醇固定5~10min，染液染15~30min，重蒸水或PBS洗示血涂片不同部位的染色效果人血涂片染色結(jié)果12345嗜中性白細(xì)胞

小淋巴細(xì)胞

嗜酸性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞單核細(xì)胞蟾蜍血鳥(niǎo)血魚(yú)血抗凝劑第二節(jié)涂片法第五章二、對(duì)蝦血淋巴涂片1、血淋巴的采集采血部位的選擇：心臟或血竇一次性大量采血或做某些理化性質(zhì)分析時(shí)從心臟取血。要保持蝦的活性從血竇取血。據(jù)對(duì)蝦體長(zhǎng)選7~9號(hào)注射頭Wright-Giemsa雙染色4%甲醛溶液固定1min50%甲醇溶液固定1min第二節(jié)涂片法第五章二、對(duì)蝦血淋巴涂片

注意：血竇采血的部位應(yīng)一致血竇采血，采血量不能過(guò)大大量采血時(shí)，在第1次抽血后停1min，再抽1次。中國(guó)對(duì)蝦血涂片，Giemsa染色第二節(jié)第二節(jié)涂片法第五章三、貝類血淋巴涂片（補(bǔ)充）1、血淋巴的采集：閉殼肌注射器中加抗凝劑或固定液Baker’甲醛鈣;0.05mol/LTris-HCl緩沖液;EM（電鏡）(含2%多聚甲醛，2.5%戊二醛，2%NaCl,2mmol/L氯化鈣，用0.2mol/L二甲砷酸鈉緩沖液配制，pH7.4)，按1：1抽取血淋巴;Alsever’s液3：1抽取血淋巴。第二節(jié)Wright-Giemsa染色酶染色密度梯度分離流式細(xì)胞儀分類血細(xì)胞第二節(jié)涂片法第五章第二節(jié)涂片法第五章四、刺參體腔液（體腔細(xì)胞）涂片（補(bǔ)充）體腔液的采集：從身體腹面或右側(cè)用注射器抽取體腔液注射器（25號(hào)針頭）中吸入等體積抗凝劑或固定液EM固定液；檸檬酸鈉：3.8mg／mL肝素鈉：0.2-0.6mg／mL草酸鈉：1.0-1.5mg／mL刺參體腔細(xì)胞：小淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、桑葚細(xì)胞和結(jié)晶細(xì)胞等第三節(jié)分離法（自學(xué)）借藥物的作用，使組織軟化、組織各組成部分之間的某些結(jié)合物質(zhì)溶解，或用機(jī)械的方法，將組織的各個(gè)組成部分分離，并使其攤開(kāi)于玻片上，制成臨時(shí)或永久性封片。

如：肌肉纖維或神經(jīng)纖維分離第五章Lumbo-sacralcordTerminalthreadAtechniqueyouknowfromusinganeedletoseparateouttheconnective-tissuefilumterminalefromthenervouscauda

equinaofdorsal&ventralrootsOntheMICROSCOPESLIDE,withaneedlepointonecanteaseapartindividualnerveormusclefibersfromtheirbundlesinnerveormuscle(Filumterminale)第四節(jié)鋪片法（自學(xué)）Spread如：皮下結(jié)締組織制片法

第五章活體染色和鋪片C.T.鋪片，VerhoeffVanGieson,ToluidineBlue

第五節(jié)滴片法以滴片法制作魚(yú)類或貝類等的染色體標(biāo)本。第五章×PHA秋水仙素第五節(jié)滴片法第五章PHA刺激48~72小時(shí)原理：

外周血小淋巴細(xì)胞，通常都處在G1期（或G0期），一般情況下不進(jìn)行分裂。若在培養(yǎng)液中加入植物血球凝集素（PHA），小淋巴細(xì)胞受到刺激可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)入有絲分裂。短期培養(yǎng)后，經(jīng)秋水仙素處理，低滲和固定，即可得到大量的有絲分裂細(xì)胞。注射PHA（植物細(xì)胞凝集素）或酵母液注射秋水仙素低滲固定滴片第五節(jié)滴片法第五章染色體制片材料的選擇：

分裂程度高

細(xì)胞易于分散

含較少的間質(zhì)和其它嗜堿性物質(zhì)染色體標(biāo)本制備程序：一、魚(yú)類染色體標(biāo)本的制備第五節(jié)滴片法第五章胚胎(卵裂期或原腸期)，上皮細(xì)胞，鰓細(xì)胞，腎（頭腎)細(xì)胞

1、材料選擇：注射部位殺死魚(yú)前8~10h或16~18h,

PHA(8~10μg/g魚(yú)體重)或酵母液(0.2~0.5ml/100g魚(yú)體重)

殺死魚(yú)前4~5h，秋水仙素(3~5μg/g魚(yú)體重)取頭腎,制備細(xì)胞懸液

0.075mol/LKCl，低滲

加固定液靜置20~30min，重復(fù)2-3次

冷滴片Giemsa染色第五節(jié)滴片法第五章第五節(jié)滴片法第五章二、貝類染色體的制作材料選擇：卵胚、幼體（囊胚期~擔(dān)輪幼蟲(chóng)期）、鰓、生殖細(xì)胞（4~8細(xì)胞期卵胚）4細(xì)胞出現(xiàn)后10~25min，每隔5min處理一批（0.03~0.04%秋水仙素，30min）低滲：25%海水，35℃，30min熱滴片固定：1：1醋酸甲醇，1：3醋酸甲醇染色皺紋盤鮑7%MgSO4或MgCl2麻醉后取鰓活體解剖取鰓50%海水配制的0.04%秋水仙素，30min低滲:25%海水，30min固定：carnoy氏液將鰓放入50%冰醋酸解離，細(xì)胞濃度（50~150）104個(gè)/ml熱滴片Giemsa染色三、對(duì)蝦染色體制片第五節(jié)滴片法第五章材料選擇:胚胎和幼體；幼蝦；成蝦時(shí)期選精巢、中腸、觸角腺或鰓

原腸期至肢芽期胚胎無(wú)節(jié)幼體0.02%秋水仙素（海水配)雄蝦注射秋水仙素（1.5μg/g蝦體重),4-6h后取精巢低滲0.3%檸檬酸鈉50%海水低滲20min,0.075mol/LKCl10-20min0.075mol/LKCl固定滴片50%醋酸解離材料：主要選擇分裂旺盛期的組織如：棘皮動(dòng)物的胚胎、幼蟲(chóng)，成體的鰓、性腺等，海參采用后期幼蟲(chóng)、耳狀幼蟲(chóng)、成體呼吸樹(shù)組織等四、棘皮動(dòng)物染色體標(biāo)本的制備（補(bǔ)充）第五節(jié)滴片法第五章5.固定液及固定時(shí)間

總結(jié)：影響染色體