東南大學(xué)生化王大勇

Chapter9:Kineticsofenzyme-catalyzedreactionsenzymekinetics:Todeterminetherateofanenzyme-catalyzedreactionandhowitchangesinresponsetochangesinexperimentalparametersisknownas~.Factors：enzymeconcentration、substrateconcentration、pH、temperature、activator、inhibitor.目前一頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點酶促反應(yīng)動力學(xué)（kineticsofenzyme—catalyzedreactions）是研究酶促反應(yīng)的速率以及影響此速率的各種因素的科學(xué)。目前二頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點意義：1）研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及作用機(jī)制。2）發(fā)揮酶催化反應(yīng)的高效率,尋找最有利的反應(yīng)條件。3）了解酶在代謝中的作用和某些藥物的作用機(jī)制。目前三頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點一、化學(xué)動力學(xué)基礎(chǔ)

（一）反應(yīng)速率及其測定

（二）反應(yīng)分子數(shù)和反應(yīng)級數(shù)

（三）各級反應(yīng)的特征目前四頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（一）反應(yīng)速率及其測定反應(yīng)速率是以單位時間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變來表示。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)物逐漸消耗，分子碰撞的機(jī)會也逐漸漸小，因此反應(yīng)速率也隨著減慢。目前五頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（二）反應(yīng)分子數(shù)和反應(yīng)級數(shù)1.反應(yīng)分子數(shù)2.反應(yīng)級數(shù)反應(yīng)分子數(shù)是在反應(yīng)中真正相互作用的分子數(shù)目。有一個反應(yīng)的分子參加的反應(yīng)為單分子反應(yīng)。有兩個反應(yīng)的分子參加的反應(yīng)為雙分子反應(yīng)。3個分子同時反應(yīng)的幾率很小?？偡磻?yīng)速率與濃度的關(guān)系以單分子反應(yīng)的速率方程式表示，為一級反應(yīng)。以雙分子反應(yīng)的速率方程式表示，為二級反應(yīng)。目前六頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（三）各級反應(yīng)的特征1.一級反應(yīng)反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度呈正比。2.二級反應(yīng)反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的二次方（兩種底物濃度的乘積）成正比。3.零級反應(yīng)反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無關(guān)而受其他因素的影響而改變的化學(xué)反應(yīng)。目前七頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點二、底物濃度對酶反應(yīng)速率的影響

（一）中間絡(luò)合物學(xué)說

（二）酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程式

（三）多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)目前八頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（一）中間絡(luò)合物學(xué)說

在酶催化的反應(yīng)中，第一步是酶與底物形成酶－底物中間絡(luò)合物。當(dāng)?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學(xué)變化后，中間復(fù)合物再分解成產(chǎn)物和酶。E+S====E-SP+E

許多實驗事實證明了E－S絡(luò)合物的存在。E－S復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)有關(guān)。目前九頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點酶催化的中間產(chǎn)物理論E+SP+EES能量水平反應(yīng)過程GE1E2酶（E）與底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個低活化能的途徑進(jìn)行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。目前十頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點1.ES復(fù)合物已被電子顯微鏡和X射線晶體結(jié)構(gòu)分析直接觀察到。2.許多酶和底物的光譜性在形成ES復(fù)合物后發(fā)生變化。3.酶的物理性質(zhì)，經(jīng)常在形成ES復(fù)合物后發(fā)生變化。4.超離心沉降過程中，可觀察到酶和底物的共沉降。目前十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（二）酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程式

1.米氏方程及推導(dǎo)

2.動力學(xué)參數(shù)的意義

3.利用作圖法測定Km和Vmax值目前十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點1.米氏方程及推導(dǎo)

底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響

米氏方程

米氏方程的推導(dǎo)目前十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響在低底物濃度時,反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。目前十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。[S]VVmax目前十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。[S]VVmax目前十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)[S]VVmax目前十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點米氏方程Km即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度目前十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點米氏方程的推導(dǎo)基本前提中間復(fù)合物學(xué)說:E+SES→E+P

目前十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點目前二十頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點2.動力學(xué)參數(shù)的意義

(1)米氏常數(shù)的意義

(2)Vmax和K3（Kcat）的意義

(3)Kcat/Km的意義目前二十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點(1)米氏常數(shù)的意義①Km是酶的一個特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。②如酶能催化幾種不同的底物，對每種底物都有一個特定的Km值，其中Km值最小的稱該酶的最適底物。③Km除了與底物類別有關(guān)，還與pH、溫度有關(guān)，所以Km是一個物理常數(shù)，是對一定的底物、一定的pH、一定的溫度而言的。目前二十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點④Km與Ks：Km不等于Ks，只有在特殊情況下即k2>>k3，Km=Ks。在Km=Ks時，Km可表示酶和底物的親和力。⑤催化可逆反應(yīng)的酶正逆方向反應(yīng)的Km是不相同的，測定細(xì)胞內(nèi)Km和正逆方向反應(yīng)的底物濃度，可大致推測正逆反應(yīng)的效率，判斷酶在細(xì)胞內(nèi)的催化的主要方向。目前二十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點(2)Vmax和K3（Kcat）的意義Vmax：在一定酶濃度下，酶對于底物的Vmax是一個常數(shù)。K3：表示當(dāng)酶被底物飽和時每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物分子數(shù)，即催化常數(shù)。目前二十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點過氧化氫酶溶菌酶目前二十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點(3)Kcat/Km的意義在生物體內(nèi)，[S]/Km比值通常介于0.01與1.0之間。Kcat/Km是E與[S]反應(yīng)形成產(chǎn)物的表觀二級速率常數(shù)。目前二十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點3.利用作圖法測定Km和Vmax值1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax目前二十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點雙倒數(shù)作圖法-1/Km1/Vmax斜率=Km/Vmax目前二十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點目前二十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點目前三十頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（三）多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)雙底物雙產(chǎn)物的反應(yīng)按動力學(xué)機(jī)制可分為兩大類:A+B P+Q

雙底物雙產(chǎn)物的反應(yīng)

序列反應(yīng)（sequentialreactions）乒乓反應(yīng)（pingpongreactions）有序反應(yīng)

（orderdreactions）隨機(jī)反應(yīng)（randomreactions）目前三十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點有序反應(yīng)及動力學(xué)方程

E+A+B—ABE—PEQ—E+P+QA為領(lǐng)先底物目前三十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點動力學(xué)方程目前三十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點目前三十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點隨機(jī)反應(yīng)動力學(xué)方程特點是：底物A和B隨機(jī)和酶結(jié)合，產(chǎn)物P和Q隨機(jī)和酶脫離目前三十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點乒乓反應(yīng)

（雙置換反應(yīng)）動力學(xué)方程雙置換反應(yīng)的特點是：酶同A的反應(yīng)產(chǎn)物（P）是酶同第二個底物結(jié)合之前釋放出來，相應(yīng)的酶轉(zhuǎn)變E’。目前三十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點目前三十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點乒乓反應(yīng)動力學(xué)方程目前三十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點乒乓反應(yīng)動力學(xué)曲線圖目前三十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點三、酶的抑制作用

（一）抑制程度的表示方法

（二）抑制作用類型

（三）可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鑒別

（四）可逆抑制作用動力學(xué)

（五）一些重要的抑制劑能夠和酶的必需基團(tuán)結(jié)合，改變必需基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，酶未發(fā)生變性，從而引起酶活性的下降，甚至使酶的活性完全喪失的現(xiàn)象稱酶的抑制作用。能引起抑制作用的物質(zhì)稱為抑制劑。目前四十頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（一）抑制程度的表示方法1.相對活力數(shù)α＝vi/v02.相對活力百分?jǐn)?shù)（殘余百分活力數(shù)）α%＝vi/v0×%3.抑制分?jǐn)?shù):指被抑制失去活力的百分?jǐn)?shù)i=1-α%=1-(vi/v0)4.抑制百分?jǐn)?shù)i%=1-α%=1-(vi/v0)×%目前四十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（二）抑制作用類型抑制作用可逆抑制不可逆抑制

競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制目前四十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點不可逆抑制抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價形式結(jié)合，引起酶的活行喪失。不能用透析、超濾等物理的方法除去抑制劑使酶復(fù)活。如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。目前四十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點可逆抑制

抑制劑與酶蛋白以非共價方式結(jié)合，引起酶活性暫時性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性。

竟?fàn)幮砸种?/p>

非竟?fàn)幮砸种?/p>

反競爭性抑制作用目前四十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點竟?fàn)幮砸种颇承┮种苿┑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。目前四十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點目前四十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點*舉例

丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸目前四十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點非竟?fàn)幮砸种泼缚赏瑫r與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競爭性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制。目前四十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點目前四十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點反競爭性抑制作用酶與底物結(jié)合后抑制劑才能和酶結(jié)合，反競爭性抑制作用常見于多底物反應(yīng)。例：肼類化合物抑制胃蛋白酶。目前五十頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（三）可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鑒別1.物理方法用透析、超濾和凝膠過濾等方法是否能除去抑制劑來鑒別可逆抑制作用和不可逆抑制作用。2.動力學(xué)方法在測定酶活力系統(tǒng)中加入一定量的抑制劑，測定酶反應(yīng)的初速度，以初速度和酶濃度作圖。目前五十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點目前五十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（四）可逆抑制作用動力學(xué)

競爭性抑制作用

非競爭性抑制作用

反競爭性抑制作用

不同類型可逆抑制劑米氏方程和常數(shù)目前五十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點

+IEIESP+EE+S競爭性抑制作用

實例：磺胺藥物的藥用機(jī)理H2N--SO2NH2對氨基苯磺酰胺H2N--COOH對氨基苯甲酸對氨基苯甲酸谷氨酸蝶呤葉酸目前五十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點競爭性抑制曲線目前五十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點非競爭性抑制作用

+IEI+SESIESP+EE+S+I實例：重金屬離子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金屬絡(luò)合劑（EDTA、F-、CN-、N3-）目前五十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點非競爭性抑制曲線目前五十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點反競爭性抑制作用ESIESP+EE+S+I目前五十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點反競爭性抑制曲線

目前五十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點不同類型可逆抑制劑米氏方程和常數(shù)目前六十頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（五）一些重要的抑制劑1.不可逆抑制劑

（1）非專一性不可逆抑制劑

（2）專一性不可逆抑制劑

2.可逆抑制劑目前六十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（1）非專一性不可逆抑制劑有機(jī)磷化合物:有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物:重金屬鹽:烷化試劑:氰化物、硫化物和CO:青霉素:目前六十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點（2）專一性不可逆抑制劑

Ks型不可逆抑制劑（親和標(biāo)記試劑）抑制劑具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，可以和相應(yīng)的酶結(jié)合，同時還帶有一個活潑的化學(xué)基團(tuán)，能和酶分子中的必需基團(tuán)結(jié)合，從而抑制酶的活性。專一性并不是很高。

Kcat型不可逆抑制劑（自殺性底物）

Kcat型抑制劑不但具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，且本身也是酶的底物，能與酶結(jié)合發(fā)生類似于底物的反應(yīng)。專一性特別高。目前六十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十八點2.可逆抑制劑可逆性抑制劑中最重要和最常見的是競爭性抑制劑。1.抗代謝物2.過渡態(tài)類似物5’氟尿嘧啶類似于尿嘧啶，影響核酸合成。對氨基苯磺酰胺類似于對氨基苯甲酸，影響葉酸合成。過渡態(tài)底物是指底物和酶結(jié)合成中間產(chǎn)物后被活化的過渡形式，和酶結(jié)合緊密，過渡態(tài)類似物和酶