Illumina平臺(tái)測(cè)序原理及常見測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

Illumina

平臺(tái)測(cè)序原理及常見幾種測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建流程簡(jiǎn)介目前一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)目錄目前二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)第一部分：測(cè)序測(cè)序原理與流程簡(jiǎn)介目前三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)文庫(kù)構(gòu)建(~

6

hrs)cBotHiSeq2500MiSeqHiSeq2000HiSeq2500GA

IIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace1-8

samples1-8

samplesDNA目前四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)Illumina

測(cè)序流程文庫(kù)構(gòu)建(~

6

hrs)cBotHiSeq25001-8

samples MiSeqHiSeq2000HiSeq25001-8

samples GA

IIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpaceDNA目前五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)文庫(kù)構(gòu)建流程片段化

DNA末端補(bǔ)平3’加A接頭連接PCR目前六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)高質(zhì)量DNA文庫(kù)結(jié)構(gòu)文庫(kù)構(gòu)建的目的是在目的DNA片段兩端都連接上想要的接頭此單鏈部分與FlowCell表面上P7接頭相同此單鏈部分與FlowCell表面上P5接頭相同Index

SequencingPrimer目前七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)文庫(kù)構(gòu)建(~

6

hrs)cBotHiSeq2500MiSeq1-8

samplesHiSeq2000HiSeq25001-8

samples GA

IIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace目前八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)測(cè)序芯片

(Flow

Cell)簡(jiǎn)介flow

cell是有2個(gè)或8個(gè)泳道(Lane)的玻璃片，與一元硬幣的厚度相當(dāng)每個(gè)泳道(Lane)內(nèi)的上下兩個(gè)表面隨機(jī)的布滿了能夠與文庫(kù)兩端接頭分別互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸(oligos,P7和P5接頭)在flow

cell上進(jìn)行cluster簇生成目前九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)儀器簡(jiǎn)介單條DNA模板約1000條DNA模板的拷貝cBotHiSeqSequenncceerr35個(gè)循環(huán)的橋式PCR目前十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)cBot

工作流程DNA文庫(kù)變性：使用NaOH將雙鏈DNA文庫(kù)變性為單鏈模板鏈雜交： 將單鏈DNA模板雜交到Flow

Cell

上第一鏈合成： 以Flow

Cell

表面上的oligos為引物，合成第一鏈橋式PCR：沖走單鏈DNA模板，以合成的第一鏈為模板進(jìn)行35循環(huán)的橋式PCR線性化：將與P5接頭連接的DNA鏈從Flow

Cell

上去除阻斷3’–OH：防止在后續(xù)測(cè)序過(guò)程中繼續(xù)延伸DNA鏈雜交測(cè)序引物目前十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA模板雜交和一鏈合成接頭序列5’-3’

延伸含有P7和P5兩種接頭的FlowCell表面單鏈DNA分子與FlowCell表面的對(duì)應(yīng)接頭雜交以雜交的單鏈DNA為模板，F(xiàn)lowCell上的接頭為引物，合成第一鏈目前十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)新合成的鏈原始模板鏈雙鏈DNA變性丟棄原始模板鏈模板鏈被沖洗走新合成的鏈留在FlowCell上目前十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)橋式PCR擴(kuò)增單鏈DNA與FlowCell表面對(duì)應(yīng)接頭雜交，形成“橋”以接頭為引物進(jìn)行擴(kuò)增目前十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)橋式PCR擴(kuò)增目前十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)變性變性雙鏈的“橋”得到與FlowCell相連的兩條互補(bǔ)的單鏈DNA分子目前十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)第二輪橋式PCR擴(kuò)增目前十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)完成橋式PCR擴(kuò)增完成28循環(huán)的橋式PCR目前十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)線性化雙鏈“橋”變性為單鏈紅色箭頭為P5接頭上的切割位點(diǎn)目前十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)線性化切割并沖走與P5接頭相連的那條DNA鏈目前二十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)阻斷阻斷3’

–OH目前二十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)雜交Read

1

引物Read1

測(cè)序引物將測(cè)序引物雜交到文庫(kù)的接頭上目前二十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)Illumina

測(cè)序流程HiSeq2000HiSeq2500GA

IIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace文庫(kù)構(gòu)建(~

6hrs)cBotHiSeq25001-8

samples MiSeq1-8

samples目前二十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)進(jìn)行Read1

測(cè)序雜交Index

測(cè)序引物，進(jìn)行Index

測(cè)序Paired

End

Turnround，合成Read1互補(bǔ)鏈雜交Read

2

測(cè)序引物，進(jìn)行Read

2

測(cè)序HiSeq

SBS

測(cè)序流程目前二十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)HiSeq

SBS

測(cè)序流程123PairedEndTurnaround目前二十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)Sequencing

By

Synthesis，SBS測(cè)序原理4種

Fl-NTP’s

+聚合酶拍照，收集信號(hào)去阻斷，切除熒光基團(tuán)X36-

151目前二十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)可逆終止化學(xué)反應(yīng)一次加入4種修飾的dNTP(可逆終止子)準(zhǔn)確度高可以得到同聚物序列合成照相，收集信號(hào)去阻斷，切除熒光基團(tuán)下一個(gè)堿基合成目前二十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)100

MicronsClusters目前二十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)已完成測(cè)序合成的片段Blocked3’-ends變性掉已完成測(cè)序合成的片段恢復(fù)被阻斷的3’

–OHPairedEnd

Turnround目前二十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)形成的

橋5’-3’延伸橋式PCR5’-3’延伸PairedEnd

Turnround目前三十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)形成的雙鏈的橋PairedEnd

Turnround目前三十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)模板鏈PairedEnd

Turnround等溫變性，完成15輪橋式PCR后，進(jìn)行線性化，將模板鏈切除，保留新合成的子鏈目前三十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)新合成的鏈3’

-OH阻斷Read2測(cè)序引物PairedEnd

Turnround線性化，3’

-OH阻斷雜交Read2測(cè)序引物目前三十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)SequencingBySynthesis2nd

ReadX36-

1514種

Fl-NTP’s

+

聚合酶拍照，收集信號(hào)去阻斷，切除熒光基團(tuán)目前三十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)Illumina

測(cè)序流程HCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace文庫(kù)構(gòu)建(~

6hrs)cBotHiSeq25001-8

samples MiSeqHiSeq2000HiSeq25001-8

samples GA

IIxMiSeq目前三十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)第二部分：常見文庫(kù)構(gòu)建流程簡(jiǎn)介目前三十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)文庫(kù)分類DNA類文庫(kù)DNA小片段文庫(kù)DNA大片段文庫(kù)Exon文庫(kù)PCR-Free文庫(kù)簡(jiǎn)化基因組文庫(kù)、單細(xì)胞樣本文庫(kù)等RNA類文庫(kù)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)表達(dá)譜（RNA-Seq）SmallRNA目前三十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA小片段文庫(kù)DNA小片段文庫(kù)片段大小在1Kb以下的普通DNA文庫(kù)（200bp,350bp,500bp…）DNA小片段文庫(kù)可用來(lái)進(jìn)行人重測(cè)序，動(dòng)植物、微生物的denovo和重測(cè)序，16s

rRNA測(cè)序，宏基因組測(cè)序等項(xiàng)目類型的文庫(kù)構(gòu)建。目前三十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA小片段建庫(kù)流程目前三十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA小片段建庫(kù)流程目前四十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA小片段建庫(kù)流程目前四十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA小片段建庫(kù)流程目前四十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA大片段文庫(kù)DNA大片段文庫(kù)，又名末端配對(duì)（mate-paired）文庫(kù)片段長(zhǎng)度大于1Kbp。主要用于動(dòng)植物，微生物的denovo測(cè)序目前四十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA大片段文庫(kù)建庫(kù)流程目前四十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)DNA大片段文庫(kù)建庫(kù)流程目前四十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)為什么要建大片段文庫(kù)目前四十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)Exon文庫(kù)人類外顯子組總共約30Mb，占全部人類基因組約1%。外顯子具有高度的保守型，且大部分疾病的致病位點(diǎn)位于外顯子區(qū)。外顯子測(cè)序是指利用序列捕獲技術(shù)將外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。Exon文庫(kù)主要用于人全外顯子測(cè)序和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序目前四十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)Exon文庫(kù)流程目前四十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)外顯子捕獲方式液相雜交液相雜交是通過(guò)在溶液中，利用鏈堿基配對(duì)的原理，將DNA片段與探針雜交，然后洗脫，富集目的片段。目前四十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)Exon測(cè)序特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1、

與全基因組測(cè)序相比，外顯子測(cè)序具有測(cè)序覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高、花費(fèi)成本更低等優(yōu)勢(shì)，對(duì)研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢(shì)。不足：1、與全基因組測(cè)序相比，不能檢測(cè)到基因組內(nèi)較大的結(jié)構(gòu)性變異。2、與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相比，不能檢測(cè)到新的基因。目前五十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)PCR-Free文庫(kù)PCR-Free文庫(kù)，顧名思義，就是在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中不需要進(jìn)行PCR的文庫(kù)。主要是針對(duì)一些特殊樣本，比如GC含量高，PCR擴(kuò)增困難的樣本；PCR產(chǎn)物。不足：所需的樣本起始量較多。目前五十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)PCR-Free文庫(kù)與普通文庫(kù)比較目前五十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)簡(jiǎn)化基因組(RAD-seq

)文庫(kù)RAD-seq

即基于酶切的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，是指利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，結(jié)合一定大小的插入片段文庫(kù)，對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序，快速鑒定高準(zhǔn)確性的變異標(biāo)記（SNPs）信息的技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該類技術(shù)操作簡(jiǎn)單、不受參考基因組限制、可簡(jiǎn)化復(fù)雜基因組；另外，基于SNPs

的分子標(biāo)記技術(shù)性價(jià)比高，穩(wěn)定性好，在基因組中分布更加廣泛，特別是適合大樣本量的分析。目前五十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)簡(jiǎn)化基因組文庫(kù)建庫(kù)流程目前五十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)真核生物原核生物總RNA利用Oligo

(dT)富集mRNA去除

rRNA隨機(jī)引物六聚體反轉(zhuǎn)錄合成cDNA末端修復(fù)，加A，加接頭后PCR擴(kuò)增Illumina

測(cè)序?qū)RNA

隨機(jī)打斷成~200

nt轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有mRNA。應(yīng)用：轉(zhuǎn)錄本的種類和基因定量基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)可變剪切發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本目前五十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)鏈特異性轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)使用ssRNA-seq可以確定轉(zhuǎn)錄本是來(lái)自正鏈還是負(fù)鏈。以便更加準(zhǔn)確的獲得基因的結(jié)構(gòu)以及基因表達(dá)信息，并且發(fā)現(xiàn)新的基因。很多基因組區(qū)域具有正負(fù)鏈的轉(zhuǎn)錄本，反義轉(zhuǎn)錄是真核基因的一個(gè)特征，是一種重要的調(diào)控方式。目前五十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)常規(guī)轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)方法基礎(chǔ)上，在合成第二條cDNA鏈時(shí)，替換dTTP為dUTP，加上接頭后降解含dU的DNA單鏈。鏈特異性轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)目前五十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于十四點(diǎn)均一化（DSN）建庫(kù)方法：構(gòu)建常規(guī)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，庫(kù)檢合格后取80-100ng文庫(kù)進(jìn)行DSN處理，然后PCR再次出庫(kù)。目的：減低高豐度表達(dá)基因，有效富集低豐度表達(dá)基因。DSN酶：雙鏈特異性核酸酶(Duplex-Specific

Nuclease,

DSN)，能夠選擇性降解雙鏈DNA和DNA-RNA雜交體中的DNA,由于高豐度的基因形成雙鏈的速度