W7免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法

Ag-Abreation:

ELISA,Immunohistochemistry,FACS,Westernblot,Hybridoma&monoclonalantibodyCellfunction:

proliferation3H－TdRMTTCFSECytotoxicity51CrAnimalexperiment目前一頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)非共價(jià)鍵結(jié)合I.Antigen-AntibodyReaction抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)抗原決定簇(antigenicdeterminant)又稱表位(epitope)非共價(jià)鍵結(jié)合目前二頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3CDR:ComplementarityDeterminingRegionFR:FrameworkRegionFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4HLComplementarity-determiningregions(CDRs):

目前三頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)AntigenicDeterminant目前四頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Specificity特異性

FeaturesofAg-AbReaction目前五頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Reversibility可逆性

Ag+Ab→Ag·Ab

解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。在一定條件下(如低pH、高濃度鹽等)可以解離。目前六頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Ratio最適比例目前七頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Sensitivity敏感性化學(xué)比色法：mg/ml酶反應(yīng)測定法：5-10μg/ml(免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿)標(biāo)記的免疫測定法：ng/ml水平(例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml)

目前八頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)ELISA------酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Immunohistochemistry--------免疫組織化學(xué)FACS------流式細(xì)胞術(shù)WesternBlotting-------免疫印跡技術(shù)Oftenusedmethods目前九頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)1.ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)RIA(radioimmunoassay,Berson&Yalow，1960)IRMA(immunoradiovelricassay,Miles&Hiles,1968)E(L)I(S)A(Engvall&Perlmann,vanWeemenandSchuurs,1971)目前十頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Copyright?2005AmericanAssociationforClinicalChemistryLequin,R.M.ClinChem2005;51:2415-2418Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2005Figure.Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2005.ThesearchwasdoneinFebruary2005inPubMed/NationalLibraryofMedicine,NIH,withthesearchterms:enzyme-immunoassay,enzyme-linkedimmunosorbentassay(EIA/ELISAcombined),andRIA.(Ordinate),numberofarticlesinwhichthekeywordsarequoted.(Abscissa),5-yearperiodsfrom1960to2005.

,combinedEIA/ELISA;

,RIA.[Note:Idonotpretendthatthenumbersinthisfigureareprecise;thetrends,however,areevident.]

目前十一頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化抗原或抗體的酶標(biāo)記用途：目標(biāo)蛋白的定性或定量分析

三個(gè)必要試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）;（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。

ELISA目前十二頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)a.包被b.抗原抗體反應(yīng)c.酶促反應(yīng),顯色d.終止顯色，讀取數(shù)據(jù)。ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過程對照和標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性對照陰性對照定量測定：標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線待測樣品的合理稀釋目前十三頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)不同類型的檢測方法目前十四頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)目前十五頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)2.Immunohistochemistry(免疫組化)原理：抗原抗體反應(yīng)，抗體標(biāo)記技術(shù)（熒光、酶）用途：組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的定性和定位流程：目前十六頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Copyright?2007AmericanAssociationforCancerResearchZhao,X.etal.CancerRes2007;67:4443-4450Figure3.mTNFinducesinfiltrationofinnateimmunecellsandangiostasisintumorsfromTNFR1–/–butnotTNFR1–/–/R2–/–mice.AtoF,TNFR1–/–miceorTNFR1–/–/R2–/–micewereinjecteds.c.with5x106ofJ-mTNF10cells.Tendaysaftertumorcellchallenge,tissuesectionsoftheinjectionsitewerestainedforMac-1+(AandB),Gr-1+(CandD),andCD31+(EandF)cellsasindicated.GandH,forconfocalmicroscopyanalysis,tissuesectionswerestainedwithCy3-labeledanti-CD31forbloodvesselendothelialcells(green)andtheVasoTACSinsitukittodetectapoptosis(red).Arrows,apoptoticendothelialcellsinthetumor.目前十七頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)成敗的關(guān)鍵因素：組織的固定、包埋抗體（特異性、濃度、孵育溫度和時(shí)間）非特異性抗原的封閉內(nèi)源性酶或自發(fā)熒光的消減顯色思考：為什么有的抗體能用于冰凍切片卻不能用于石蠟切片？目前十八頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)3.FlowCytometricanalysis(流式細(xì)胞術(shù))FACS:(Fluorescence-ActivatedCellSorter)BDFACSVantageBD-Calibur目前十九頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)測量對象

大小懸浮在溶液中的相互離散顆粒大小范圍：0.2μm-300μm

高等真核細(xì)胞類型酵母細(xì)胞類型細(xì)菌 多細(xì)胞的聚集體，如胰島等。細(xì)胞核非生命顆粒染色體其它細(xì)胞器以及乳化微球等。

目前二十頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)細(xì)胞表型分析胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測細(xì)胞周期和DNA倍體分析細(xì)胞分選主要用途目前二十一頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)（1）多參數(shù)定量分析每一個(gè)細(xì)胞；

（2）細(xì)胞分選；高純度：99%以上；可分析小于1/10000比例的稀有細(xì)胞群、單細(xì)胞克隆等。

(3）高通量（分析分選）．分析150，000個(gè)/秒分選100，000個(gè)/秒

特點(diǎn)目前二十二頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)

基本結(jié)構(gòu)目前二十三頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)工作原理目前二十四頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細(xì)胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光a.光信號收集分離，導(dǎo)向，各探測通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。目前二十五頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)FSCSSCFL1FL2FL3對數(shù)

線性線性

線性

對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果b.數(shù)據(jù)處理目前二十六頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)c.細(xì)胞分選488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector目前二十七頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖

（紅細(xì)胞溶解后）顆粒度細(xì)胞大小流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析非熒光信號目前二十八頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)直方圖分析熒光信號目前二十九頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)點(diǎn)狀圖分析目前三十頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)設(shè)門分析

可以通過設(shè)“門”(Gate)，分析、分選感興趣的細(xì)胞。目前三十一頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)對照的設(shè)計(jì)

陰性對照：常用同型抗體對照陽性對照：單陽性對照（多色分析時(shí)用于儀器校正）

抗體的選擇

首選直標(biāo)抗體熒光分子

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理

單細(xì)胞懸液的制備抗體濃度非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉

目前三十二頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)4.WesternBlott目前三十三頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)5.HybridomaTechnique&MonoclonalAntibodyPreparationJerme，K?hlerandMilstein1984NobelPrizeBcellMyelomaSecreteAbClonalAclonalcelllinesecretingspecificAb?目前三十四頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)BcellMyelomaFusionBcellBcell+BcellBcell+MyelomaMyelomaMyeloma+Myelomaalive目前三十五頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Bcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaDNAA(氨基喋呤)HGPRT+，TK+

H,次黃嘌呤

T,胸腺嘧啶HGPRT-，TK-DieHGPRT-，TK-

H,次黃嘌呤

T,胸腺嘧啶AclonalcelllinesecretingspecificAb---HybridomaHGPRT次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)TK胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase)目前三十六頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)目前三十七頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)PreparingmAbsfrommurineascitesPristane(i.p.)Hybridoma(i.p.)ascitesMonoclonalantibodyELISA目前三十八頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)II.AssayforcellfunctionProliferation:Tcell,tumorcell,…Cytotoxicassay:Tcell,NKcell,…目前三十九頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)CellProliferationStimulatorsNonspecific:Mitogen:LPS,ConA,PHASuperantigen(超抗原):SEBCytokine:IL2,IL4,TNFAntibody:CD3,TCR,CD28Specific:specificantigen:破傷風(fēng)類毒素，PPD(純結(jié)核蛋白衍生物)MHC:同種異體細(xì)胞(MLR,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng))目前四十頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)AssayforTcellproliferation3H-TdRwashStimulateAssaya.3H-TdR目前四十一頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)b.MTTAssayMechanism:

操作簡單，重復(fù)性差目前四十二頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)c.CFSEFigure15.67FollowingcellproliferationinhumanperipheralbloodlymphocytesusingtheCellTraceCFSECellProliferationKitC34554).HumanperipheralbloodlymphocyteswereharvestedandstainedwithCellTraceCFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester;5(6)-CFDA,SE)onDay0.AportionofthepopulationwasarrestedattheparentgenerationusingmitomycinC(redpeak).Theremainderofthesamplewasstimulatedwithphytohemagglutininandallowedtoproliferatefor5days.Solidgreenpeaksrepresentsuccessivegenerations./handbook/figures/2018.html

CELLproliferation目前四十三頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)AssayforTcellcytotoxicityTargetcell51CrlabeledTargetcellCTLTargetcellCr51releaseAssayCTL51Crrelease目前四十四頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Isolationofstemcells密度梯度離心法單抗貼壁鋪展法免疫磁珠分選流式細(xì)胞分選法III.Technologyinvolvedinstemcellresearch目前四十五頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)IndentificationofstemcellsFACS：造血干細(xì)胞可鑒定如下marker—CD34，CD33，Sca-1，c-Kit顯微鏡技術(shù)：生長形態(tài)，核型人類骨髓干細(xì)胞體內(nèi)分化：胚胎干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長分化，形成包含三個(gè)胚層來源的良性畸胎瘤基因芯片：分析基因表達(dá)差異目前四十六頁\總數(shù)五十八頁\編于十七點(diǎn)Cultureofisolatedstemcells以鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)為例：1，飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)2，飼養(yǎng)層的制備—MEF分離3，小鼠胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)1）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離與培養(yǎng)2）ES樣細(xì)胞擴(kuò)增3）單細(xì)胞克隆建系