重組人胰島素生產(chǎn)工藝

重組人胰島素和重組人生長激素生產(chǎn)工藝2010.4.13第一頁，共二十七頁。重組人胰島素

定義：

胰島素是由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。胰島素的生物合成胰島素合成的控制基因在第11對染色體短臂上。在β細胞的細胞核中，胰島素基因區(qū)DNA向mRNA轉錄，mRNA從細胞核移向細胞漿的內(nèi)質網(wǎng)，轉譯成由109個氨基酸殘基構成的前胰島素原。前胰島素原經(jīng)過蛋白水解作用除其前肽，生成86個氨基酸組成的長肽鏈——胰島素原（Proinsulin）。胰島素原隨細胞漿中的微泡進入高爾基體，經(jīng)蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三個精氨酸連接的鏈，斷鏈生成沒有作用的C肽，同時生成胰島素，分泌到β細胞外，進入血液循環(huán)中。未經(jīng)過蛋白酶水解的胰島素原，生物活性僅有胰島素的10%。結構：胰島素由A、B兩個肽鏈組成。A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵。

第二頁，共二十七頁。豬胰島素牛胰島素賴脯人胰島素（禮來公司、速效Ins）

門冬胰島素（諾和諾德公司、速效Ins）

甘精胰島素

(安萬特公司、長效Ins)人胰島素原B30A8;A10;B30

B28;B29B28A21;B31;B32第三頁，共二十七頁。3DStructureofInsulin胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer

）第四頁，共二十七頁。Ins的性質

第五頁，共二十七頁。胰島素的功能胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素。藥理作用治療糖尿病、消耗性疾病。目前臨床使用的胰島素來源1、動物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個氨基酸不同，牛胰島素中有3個氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體。2、半合成人胰島素：將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素。

3、重組人胰島素（現(xiàn)階段臨床最常使用的胰島素）：利用生物工程技術，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。

第六頁，共二十七頁。1921年----從動物胰腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療的歷史。

1926年----重結晶胰島素

1930s----傳統(tǒng)中、長效動物胰島素

1970s----單峰胰島素和單組分胰島素

70年代末----半合成胰島素

1982年----采用基因重組技術生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今----重組人胰島素類似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長效人胰島素類似物。第七頁，共二十七頁。動物來源的胰島素（28種）藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)ILETINILILLYNPHPURIFIEDPORKISOPHANEINSULINNOVONORDISKINCILETINIILILLYPROTAMINEZINC&ILETINI(BEEF-PORK)LILLYINSULINNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINIILILLYINSULININSULATARDNPHNORDISKNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINII(PORK)LILLYINSULINNORDISKMIXTARD(PORK)NOVONORDISKINCPROTAMINEZINCINSULINBRISTOLMYERSSQUIBBLENTARDNOVONORDISKINCREGULARILETINIILILLYLENTENOVONORDISKINCREGULARILETINII(PORK)LILLYLENTEILETINIILILLYREGULARPURIFIEDPORKINSULINNOVONORDISKINCLENTEILETINII(PORK)LILLYREGULARINSULINNOVONORDISKINCLENTEINSULINNOVONORDISKINCSEMILENTENOVONORDISKINCNPHILETINI(BEEF-PORK)LILLYSEMILENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHILETINIILILLYULTRALENTENOVONORDISKINCNPHILETINII(PORK)LILLYULTRALENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHINSULINNOVONORDISKINCVELOSULINNOVONORDISKINC第八頁，共二十七頁。半合成來源的胰島素（5種）藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)INSULATARDNPHHUMANNOVONORDISKINCMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSNOVOLIN70/30NOVONORDISKINCNOVOLINLNOVONORDISKINCNOVOLINNNOVONORDISKINC第九頁，共二十七頁?；蛑亟M來源的胰島素（27種）藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)APIDRASANOFIAVENTISUSLANTUSSANOFIAVENTISUSEXUBERAPFIZERLEVEMIRNovoNordiskHUMALOGLILLYMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSHUMALOGMIX50/50LILLYNOVOLIN70/30NovoNordiskHUMALOGMIX75/25LILLYNOVOLINLNOVONORDISKINCHUMALOGPENLILLYNOVOLINNNOVONORDISKINCHUMULIN50/50LILLYNOVOLINRNOVONORDISKINCHUMULIN70/30LILLYNOVOLINR（Purified）NOVONORDISKINCHUMULIN70/30PENLILLYNOVOLOGNOVONORDISKINCHUMULINBRLILLYNOVOLOGMIX70/30NOVONORDISKINCHUMULINLLILLYVELOSULINBRNOVONORDISKINCHUMULINNLILLYVELOSULINBRHUMANNOVONORDISKINCHUMULINRLILLYHUMULINULILLYHUMULINRPENLILLY第十頁，共二十七頁。通化東寶

1998年12月研制出中國第一支基因重組胰島素“甘舒霖”

甘舒霖?R--常規(guī)重組人胰島素注射液甘舒霖?N--低精蛋白重組人胰島素注射液甘舒霖?30R--30/70混合重組人胰島素注射液（30%常規(guī)重組人胰島素和70%低精蛋白重組人胰島素）深圳科興蘇泌啉--常規(guī)重組人胰島素注射液蘇泌啉恩--低精蛋白重組人胰島素注射液徐州萬邦

萬邦林--常規(guī)重組人胰島素注射液萬蘇林—豬胰島素制劑胰島素國內(nèi)主要生產(chǎn)廠家其他（持有藥品注冊證）---南京新天生物化學制藥有限公司、華西醫(yī)科大學制藥廠、上海第一生化制藥廠、武漢生化制藥廠等第十一頁，共二十七頁。臨床用胰島素分類普通胰島素：從動物胰臟中提取人胰島素傳統(tǒng)中長效胰島素

長效人胰島素類似物速效人胰島素類似物非注射胰島素第十二頁，共二十七頁。

傳統(tǒng)中長效胰島素制劑

低精蛋白鋅胰島素：胰島素、魚精蛋白和鋅的結晶。例：禮來公司，HumulinN(rDNA、大腸桿菌)諾和諾德，NovolinN(rDNA、釀酒酵母)

胰島素鋅混懸液：精蛋白鋅胰島素與常規(guī)胰島素的混懸液例：禮來公司，Humulin30/70(30%常規(guī)胰島素，70%精蛋白鋅胰島素)Humulin50/50諾和諾德，Novolin30/70Novolin50/50缺陷：作用時間少于24小時作用峰值明顯，夜間低血糖危險性高吸收不穩(wěn)定結霜現(xiàn)象，由于溫度過冷或過熱導致胰島素再玻璃瓶壁沉淀，喪失活性第十三頁，共二十七頁。速效胰島素特點：起效快，皮下注射后15分鐘起效。達峰快，注射后15分鐘起效，30～60分鐘達到藥效高峰。藥效維持時間短，大約在3小時左右（2～4小時）。藥代動力學特點與進餐后人體內(nèi)源性胰島素分泌十分相似，能夠很好地控制當餐后血糖而且不容易發(fā)生低血糖。起效時間達峰時間峰持續(xù)時間作用消除時間常規(guī)皮下Ins:30-90min1.5-2.5h2-4h6-8h生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4h第十四頁，共二十七頁。Lispro（賴脯胰島素，Humalog?）是第一個用于臨床的速效胰島素類似物,由美國禮來公司研制生產(chǎn)，將人胰島素的B28與B29位的氨基酸對換。。Aspart（門冬胰島素，Novolog?）由丹麥諾和諾德公司研制生產(chǎn)，結構與人胰島素的區(qū)別在于用天冬氨酸取代了B鏈28位上的脯氨酸。APIDRA（賴谷胰島素，Apidra?）安萬特公司研制，以賴氨酸和谷氨酸分別取代了人胰島素B3位的天冬氨酸和B29位的賴氨酸。第十五頁，共二十七頁。長效胰島素-人胰島素類似物1.

甘精胰島素（glargine）：商品名Lantus?------甘氨酸替代胰島素A鏈21位門冬氨酸、并在B鏈末端增加兩個精氨酸。

●使胰島素結合更多帶正電的氨基酸殘基，改變等電點，使等電點由5.4上升至中性。這樣，胰島素類似物在酸性條件下可溶，在生理的近中性條件下結晶。2.InsulinDetemir：商品名Levemir?

------胰島素B鏈29位賴氨酸側鏈通過?；B接一個N-16-烷基酸的14碳游離脂肪酸●該游離脂肪酸能與白蛋白結合，延緩與胰島素受體結合，從而延長其半衰期。

第十六頁，共二十七頁。InsulinDetemir（Levemir?）諾和諾德公司研制

glargine（Lantus?）安萬特公司研制第十七頁，共二十七頁。胰島素肺部吸入制劑--------Exubera●輝瑞、萬安特以及Nektar共同研發(fā)●于2006.1.27被FDA批準●一種作用快的胰島素干粉吸入劑●適用于餐前給藥，其胰島素吸收具有速效化的特征第十八頁，共二十七頁。胰島素制備工藝以動物胰臟為原料提取胰島素----酸醇提取法

※傳統(tǒng)胰島素---豬、牛胰臟提取，只經(jīng)一步重結晶

※單峰胰島素----凝膠過濾純化

※單組分胰島素---凝膠過濾、離子交換純化半合成胰島素----以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術生產(chǎn)人胰島素

※AB鏈合成：分別表達AB鏈，化學方法連接

※逆轉錄法：表達胰島素原，酶切得到重組人胰島素第十九頁，共二十七頁。重組DNA技術制造人胰島素

AB鏈合成法：以人工合成的人胰島素A鏈和B鏈基因分別與半乳糖苷酶基因連接，形成融和基因，分別在大腸桿菌中表達A鏈和B鏈，然后再通過化學氧化作用，通過二硫鍵連接起來?！驯惶蕴崔D錄酶法：仿照天然合成途徑通過胰島素原的cDNA合成，表達產(chǎn)物是胰島素原，經(jīng)工具酶切開，除去C-肽得人胰島素。第二十頁，共二十七頁。InsA鏈InsB鏈轉化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素第二十一頁，共二十七頁。質粒InsmRNA反轉錄InscDNA轉化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切

提取質粒限制性內(nèi)切酶酶切

反轉錄酶法合成人胰島素第二十二