蛋白質(zhì)測序分離及提純

關(guān)于蛋白質(zhì)測序分離及提純第1頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)紫外吸收：最大吸收峰為280nm兩性解離：蛋白質(zhì)的pI值不能直接計算，只能使用等電聚焦等方法進行測定膠體性質(zhì)沉淀反應(yīng)：鹽析、pI沉淀、有機溶劑引起的沉淀和重金屬鹽作用造成的沉淀變性、復性水解顏色反應(yīng)第2頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.6.1蛋白質(zhì)的性質(zhì)第3頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.6.2蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀第5頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

蛋白質(zhì)溶液有膠體溶液的性質(zhì)，如：擴散慢、易沉降、粘度大、不能透過半透膜，在水溶液中可形成親水的膠體。

蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當破壞這兩個因素時，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。

蛋白質(zhì)是相對分子質(zhì)量很大的生物分子,相對分子質(zhì)量一般在10000～1000000之間或更大一些.+++++++++++++++++++++++++++第6頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.6.3

變性

、復性

（1）變性：在某些理化因素作用下，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導致其理化性質(zhì)改變、生物活性喪失的現(xiàn)象稱為變性。變性不涉及一級結(jié)構(gòu)的變化。使蛋白質(zhì)變性的因素（1）物理因素：高溫、高壓、超聲波、紫外線射線等

（2）化學因素：有機溶劑、強酸、強堿、重金屬鹽等第8頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月變性的本質(zhì)：分子中各種次級鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級結(jié)構(gòu)不破壞。蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：（1）生物學活性消失

（2）理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，側(cè)鏈反應(yīng)增強，對酶的作用敏感，易被水解。

第9頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）復性：去除變性因素回復原來結(jié)構(gòu)與功能。變性并非是不可逆的變化，當變性程度較輕時，如去除變性因素，有的蛋白質(zhì)仍能恢復或部分恢復其原來的構(gòu)象及功能，變性的可逆變化稱為復性。（3）應(yīng)用①利用變性：酒精消毒高壓滅菌②防止變性：低溫保存生物制品③取代變性：乳品解毒(用于急救重金屬中毒)第10頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.6.4

蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀（1）沉淀：不穩(wěn)定蛋白質(zhì)從溶液中析出（2）結(jié)絮：變性蛋白質(zhì)的絮狀沉淀，沉淀可溶于強酸、強堿（3）凝固：沉淀結(jié)塊，凝塊不溶于強酸、強堿蛋白質(zhì)在溶液中維持穩(wěn)定的因素：表面電荷、水化層（溶劑化層）變性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定變性第11頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)的沉淀

Pr從膠體溶液中析出

Ⅰ可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當條件下可重新溶解

——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等

第12頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月不可逆沉淀強烈沉淀條件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ第13頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月①.鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性第14頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月②.有機溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用③.等電點沉淀第15頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月④.重金屬鹽沉淀與帶負電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽⑤.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽⑥.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)第16頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.6.5

蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)酚試劑反應(yīng)→蛋白質(zhì)定量、定性

茚三酮反應(yīng)測定常用方法

第17頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月雙縮脲反應(yīng)(堿性溶液)Cu2+紅紫色絡(luò)合物

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物第18頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

Folin(福林試劑）-酚試劑反應(yīng)

蛋白質(zhì)分子中含有一定量的酪氨酸殘基，其中的酚基在堿性條件下與福林試劑的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍色化合物。第19頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩層之間就會出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基的化合物都有這一反應(yīng)。第20頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月坂口反應(yīng)精氨酸分子中含有脈基，能與次氯酸鈉（或次溴酸鈉）及ɑ-萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物。此反應(yīng)可以用來鑒定含有精氨酸的蛋白質(zhì)。第21頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月米倫反應(yīng)米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液，蛋白質(zhì)溶液加入米倫試劑后即產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。酚類公化合物有此反應(yīng)。第22頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月紫外吸收蛋白質(zhì)分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，這些氨基酸的側(cè)鏈基團具有紫外光吸收能力，最大吸收峰在在280nm處，故通過對280nm波長的紫外吸光度的測量可對蛋白質(zhì)溶液進行定量分析。第23頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.7蛋白質(zhì)分離提純及分析技術(shù)第24頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.7.1蛋白質(zhì)分子量及其確定方法蛋白質(zhì)相對分子量在6000～1000000之間。測定分子量的主要方法有化學組成法、滲透壓法、超離心法（沉降分析法）、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。第25頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月化學組成法:最低M=元素(分子)分子量/元素(分子)百分含量滲透壓法:Mr=cRT/Π超離心法:Mr=RTs/[(1-υρ)D]凝膠過濾:logMr

=K1-K2VeSDS－PAGE法:logMr=α-bμR氨基酸序列分析計算第26頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月元素原子量(分子分子量)最低相對分子量=

元素(分子)百分含量肌紅蛋白含鐵量為0.335%，其最低分子量可按下式算出：

Fe原子量(55.8)最低相對分子量=Fe元素百分含量(0.335%)=16700化學組成測定最低相對分子量第27頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月真實分子量是最低相對分子質(zhì)量的n倍，這里n是每個蛋白質(zhì)分子中鐵原子的數(shù)目。因為肌紅蛋白中，n＝l，所以其真實Mr就是16700。又如血紅蛋白含鐵也是0.335%，即最低Mr亦為16700，但根據(jù)其他方法測得的Mr是68000。可見每一分子血紅蛋白含有四個鐵原子，即n＝4，因此其真實Mr＝16700×4=66800。第28頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月有時蛋白質(zhì)分子中某一氨基酸的含量特別少，應(yīng)用同樣的原理，由這一氨基酸含量的分析結(jié)果，也可以計算蛋白質(zhì)的最低相對分子質(zhì)量。例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，計算所得的最低相對分子質(zhì)量是35200。用其他方法測得的Mr是69000，所以每分子牛血清清蛋白含有兩個色氨酸殘基。第29頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.7.2蛋白質(zhì)純化總目標：增加制品純度或比活1.前處理：因動/植物/細菌而異2.粗分級分離：采用鹽析/等電點沉淀/有機溶劑分級分離等方法3.細分級分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶第30頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）利用溶解度差別的分離方法1.等電點沉淀和pH控制

當?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點pH值，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有斥力而趨向于凝聚而沉淀。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低的理可以把蛋白質(zhì)混合物分離開來。蛋白質(zhì)混合物的分離純化方法第31頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析

中性鹽對蛋白質(zhì)有明顯的溶解度影響。在低濃度時，中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱鹽溶。鹽溶主要由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用卻加強。鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中大量加入中性鹽使水的活度降低，原來溶液中大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團與水分子之間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。第32頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月3.有機溶劑分級法有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。第33頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）根據(jù)分子大小不同的分離方法1.過濾與膜分離

借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆粒或分子進行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。第34頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.離心分離離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。常速離心機又稱為低速離心機,其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。第35頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月高速離心機的最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，相對離心力達到1×104～1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機的最大轉(zhuǎn)速達(2.5～12)×104r/min，相對離心力可以高達5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。第36頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月3.凝膠過濾層析（gel-filtrationchromatography）凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。第37頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）根據(jù)電荷不同進行分離1.電泳帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。第38頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

1）區(qū)帶電泳是由于在支持物上電泳時各組分因遷移速度不同分布成區(qū)帶而的名。區(qū)帶電泳按其支持介質(zhì)的物理性質(zhì)不同可以分為四類：（1）紙電泳和聚酰胺薄膜電泳；（2）粉末電泳，支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉與適當?shù)娜軇┱{(diào)和而成，鋪設(shè)成平板；（3）細絲電泳，如尼龍絲和其他人造絲；（4）凝膠電泳，最常用的支持介質(zhì)是聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。第39頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide，Bis)在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過硫酸銨(AP)的作用下聚合形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。凝膠的濃度和孔徑可調(diào)節(jié)。第40頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.離子交換層析離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。第41頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）蛋白質(zhì)的選擇吸附某些物質(zhì)對蛋白質(zhì)有選擇吸附，利用對不同的蛋白質(zhì)的吸附能力不同而得到分離。常用的吸附劑有結(jié)晶磷酸鈣。第42頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）親和層析

親和層析（affinitychromatography)是一種有效分離蛋白質(zhì)的層析方法，它經(jīng)常只需要一步即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，并且純度很高。親和層析是基于某種蛋白質(zhì)的生物特異性，即它與另外一種稱配基的分子能特異而非共價結(jié)合。第43頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2.7.3蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。第44頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）蛋白質(zhì)順序測定基本戰(zhàn)略將肽段順序進行疊聯(lián)以確定完整的順序?qū)㈦亩畏蛛x并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)第45頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月(