第09章-干細(xì)胞術(shù)

第一節(jié)干細(xì)胞概述(ɡàishù)

干細(xì)胞（stemcells）是一類未分化的或原始的、具有自我(zìwǒ)更新能力（self-renewing）的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，可以分化成機(jī)體內(nèi)的多功能細(xì)胞，形成任何類型的組織和器官，以實(shí)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)部構(gòu)建和自我康復(fù)能力。干細(xì)胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。目前，人類胚胎干細(xì)胞可成功地在體外培養(yǎng)，成體干細(xì)胞可以橫向分化為其他類型的細(xì)胞和組織，為干細(xì)胞的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。第二頁(yè)，共二十三頁(yè)。

一、干細(xì)胞的分類與來(lái)源（一）干細(xì)胞的分類1．按照生存階段分類干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞（ESC）和成體干細(xì)胞（ASC）。胚胎干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞（EGC）。成體干細(xì)胞包括骨髓(ɡǔsuǐ)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）、血液干細(xì)胞（HSC）、表皮干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）等。

2．按分化潛能分類干細(xì)胞可分為全能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞第三頁(yè)，共二十三頁(yè)。

（1）全能干細(xì)胞：具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如胚胎干細(xì)胞，具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和很強(qiáng)的分化能力，可以無(wú)限增殖(zēngzhí)并分化成為全身200多種細(xì)胞類型，進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織、器官，最終發(fā)育成一個(gè)完整的個(gè)體。受精卵就是一個(gè)最初始的全能干細(xì)胞。

（2）多能干細(xì)胞：具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。骨髓多能造血干細(xì)胞是典型的例子，它可分化出至少十二種血細(xì)胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細(xì)胞。

（3）單能干細(xì)胞：也稱專能、偏能或定向干細(xì)胞，只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化，如上皮組織基底層的干細(xì)胞，肌肉中的成肌細(xì)胞或衛(wèi)星細(xì)胞。第四頁(yè)，共二十三頁(yè)。

（二）干細(xì)胞的來(lái)源

1．胚胎干細(xì)胞可來(lái)源于畸胎瘤細(xì)胞、桑椹球細(xì)胞、囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、擬胚體細(xì)胞、生殖原基細(xì)胞等。

ESC是在人胚胎發(fā)育早期——囊胚（受精后5~7d）中未分化的細(xì)胞。囊胚含有約140個(gè)細(xì)胞，外表是一層扁平細(xì)胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持組織如胎盤等。中心的腔稱囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)的細(xì)胞群，稱內(nèi)細(xì)胞群，這些未分化的細(xì)胞可進(jìn)一步分裂、分化，發(fā)育成個(gè)體。將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，在一定條件下，這些細(xì)胞可在體外“無(wú)限期”地增殖傳代(chuándài)，同時(shí)還保持其全能性，因此被稱為ESC。胚胎干細(xì)胞具有全能性，可以自我更新并具有分化為體內(nèi)所有組織的能力。第五頁(yè)，共二十三頁(yè)。

2．成體干細(xì)胞成年動(dòng)物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力。在特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化形成新的功能細(xì)胞，從而(cóngér)使組織和器官保持生長(zhǎng)和衰退的動(dòng)態(tài)平衡。成體干細(xì)胞可以由下列幾個(gè)方面得到：胚胎細(xì)胞——由ESC定向分化或移植分化而成。胚胎組織——由分離胚胎組織、細(xì)胞分離或培養(yǎng)而成。成體組織——由臍血、骨髓、外周血、骨髓間質(zhì)和脂肪細(xì)胞等得到。第六頁(yè)，共二十三頁(yè)。

二、干細(xì)胞的應(yīng)用研究1．胚胎干細(xì)胞育出心臟組織

以色列科學(xué)家從胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)出的人類心臟組織，可以自然跳動(dòng)，并且有新生心臟組織的電特性和機(jī)械性。實(shí)驗(yàn)證明，以細(xì)胞移植治療心臟病是可能的。德國(guó)醫(yī)生使用病人自身的干細(xì)胞治療心肌梗塞取得了可喜的成果(chéngguǒ)。

2．骨髓干細(xì)胞育出腎臟組織

英國(guó)科學(xué)家用骨髓干細(xì)胞培育出了腎臟組織，這在器官移植手術(shù)中是一個(gè)重大突破，醫(yī)生可通過(guò)修補(bǔ)受損腎臟達(dá)到治療的目的。同時(shí)，也證明了成人骨髓干細(xì)胞可以發(fā)育成成熟的腎臟細(xì)胞。

第七頁(yè)，共二十三頁(yè)。

3．臍血干細(xì)胞

由干臍帶血和胎盤含有大量的干細(xì)胞，因而受到越來(lái)越多的重視和利用。1979年，醫(yī)學(xué)界首次發(fā)現(xiàn)臍帶血中含有恢復(fù)白血病患者造血功能的細(xì)胞。自1998年以來(lái)，從胎盤和臍帶血中提取出來(lái)的血液(xuèyè)，已挽救了數(shù)百人的生命。

4．皮膚干細(xì)胞我國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)，人體燒傷皮膚原位處存在著皮膚干細(xì)胞，利用它在一定藥劑調(diào)控下，能使燒傷的皮膚原位再生，修復(fù)如初。這是我國(guó)在皮膚干細(xì)胞研究及其臨床應(yīng)用上的重大突破。第八頁(yè)，共二十三頁(yè)。

5．胰島干細(xì)胞美國(guó)Ramiya等從尚未發(fā)病的糖尿病小鼠胰島導(dǎo)管中分離出胰島干細(xì)胞，在體外誘導(dǎo)分化成產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，接受移植的糖尿病鼠血糖濃度控制良好，而對(duì)照組小鼠死于糖尿病，為干細(xì)胞治療糖尿病奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

6．神經(jīng)干細(xì)胞由于分離神經(jīng)干細(xì)胞所需的胎兒腦組織較難取材，加之胚胎細(xì)胞研究尚存在爭(zhēng)議，神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于初級(jí)階段。腦和脊髓由于血腦屏障的存在，使之在干細(xì)胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)后不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，如給帕金森綜合癥患者的腦內(nèi)移植含有多巴胺生成細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞，可緩解部分(bùfen)患者癥狀。第九頁(yè)，共二十三頁(yè)。

三、干細(xì)胞應(yīng)用平臺(tái)技術(shù)1．技術(shù)原理細(xì)胞分化過(guò)程中，往往由于高度分化而完全失去再分裂的能力，最終衰老(shuāilǎo)死亡。機(jī)體在發(fā)展適應(yīng)過(guò)程中為了禰補(bǔ)這一不足，保留了一部分未分化的原始細(xì)胞，稱為干細(xì)胞。一旦生理需要，這些干細(xì)胞可按照發(fā)育途徑通過(guò)分裂而產(chǎn)生分化細(xì)胞，即干細(xì)胞充當(dāng)了分化細(xì)胞“預(yù)備隊(duì)”的角色。在動(dòng)物體內(nèi)，多數(shù)組織含有干細(xì)胞，甚至在進(jìn)化的早期，最初級(jí)的后生動(dòng)物——海綿也含有稱之為“始祖母細(xì)胞”的干細(xì)胞。第十頁(yè)，共二十三頁(yè)。

（1）干細(xì)胞的特點(diǎn)：①干細(xì)胞本身不是處于分化途徑的終端。②干細(xì)胞能無(wú)限的增殖分裂。③干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)。

（2）干細(xì)胞的分裂方式：一是對(duì)稱分裂，形成兩個(gè)相同的干細(xì)胞。二是非對(duì)稱分裂，由于細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分配，使得一個(gè)子細(xì)胞不可逆的走向分化的終端成為功能專一的分化細(xì)胞；另一個(gè)保持(bǎochí)親代的特征，仍作為干細(xì)胞保留下來(lái)。分化細(xì)胞的數(shù)目受分化前干細(xì)胞的數(shù)目和分裂次數(shù)控制?？梢哉f(shuō)，干細(xì)胞是具有多潛能和自我更新特點(diǎn)的、增殖速度較緩慢的細(xì)胞。第十一頁(yè)，共二十三頁(yè)。

2．技術(shù)方向凡需要不斷產(chǎn)生新的分化(fēnhuà)細(xì)胞和分化(fēnhuà)細(xì)胞本身不能再分裂的細(xì)胞或組織，都要通過(guò)干細(xì)胞所產(chǎn)生的具有分化(fēnhuà)能力的細(xì)胞來(lái)維持機(jī)體細(xì)胞的數(shù)量。生命體是通過(guò)干細(xì)胞的分裂，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的更新而保證持續(xù)生長(zhǎng)。隨著基因工程、胚胎工程、細(xì)胞工程等生物技術(shù)的發(fā)展，按照一定的目的，在體外人工分離、培養(yǎng)干細(xì)胞已成為可能，利用干細(xì)胞構(gòu)建各種細(xì)胞、組織、器官作為移植器官的來(lái)源，將成為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。第十二頁(yè)，共二十三頁(yè)。3．技術(shù)突破

一是人類胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功。1998年，JamesThomson和JohnGearhart從人囊胚的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)中取得胚胎干細(xì)胞，將胚胎干細(xì)胞與小鼠的骨髓間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明胚胎干細(xì)胞可以進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的非分化增殖，同時(shí)還保持著分化為滋養(yǎng)層組織及三種胚層組織的能力，為胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用奠定(diàndìng)了基礎(chǔ)。另一個(gè)重大突破是成體干細(xì)胞的橫向分化。1999年，Goodell等用肌肉來(lái)源的干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)分化成各種血細(xì)胞，這表明成體干細(xì)胞在一定的微環(huán)境作用下，可以橫向分化為需要的細(xì)胞和組織，從而起到極為有效的治療作用。第十三頁(yè)，共二十三頁(yè)。4．干細(xì)胞的分離與純化體外干細(xì)胞分離的方法(fāngfǎ)，首先是從已被證明含有干細(xì)胞的胚胎或成年哺乳動(dòng)物的器官中取材，然后將所取的組織進(jìn)行解離分散，最后將已分離的細(xì)胞暴露于含有高濃度促細(xì)胞分裂劑的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的增殖后，撤消促細(xì)胞分裂劑而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行分化（如向神經(jīng)元方向分化），或把細(xì)胞暴露于其它因子中使其中的一些細(xì)胞發(fā)育為不同的細(xì)胞系。

5．干細(xì)胞的體外培養(yǎng)由于干細(xì)胞的數(shù)目很少，需要在體外對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行非分化性增殖。這需要許多生長(zhǎng)因子和間質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)。第十四頁(yè)，共二十三頁(yè)。Brustle等在體外成功地培養(yǎng)了鼠的表皮干細(xì)胞，首先把分離的表皮干細(xì)胞在含有成纖維細(xì)胞因子2（FGF-2）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后加入上皮生長(zhǎng)因子（EGF），最后在FGF-2和血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）的混合培養(yǎng)基中生長(zhǎng)增殖。在這種培養(yǎng)條件下，表皮干細(xì)胞可以保持其分化潛能，如停止供給生長(zhǎng)因子，表皮干細(xì)胞會(huì)分化為寡樹(shù)突細(xì)胞或星狀細(xì)胞。不同組織來(lái)源的干細(xì)胞的培養(yǎng)條件不盡相同。在應(yīng)用前還需依據(jù)靶組織類型對(duì)培養(yǎng)干細(xì)胞進(jìn)行(jìnxíng)定向分化誘導(dǎo)。準(zhǔn)確的分化誘導(dǎo)是應(yīng)用干細(xì)胞治療的基礎(chǔ)，這需要對(duì)與干細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的信號(hào)調(diào)節(jié)及微環(huán)境的影響進(jìn)行(jìnxíng)詳細(xì)研究第十五頁(yè)，共二十三頁(yè)。第二節(jié)胚胎(pēitāi)干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞（ESC）是在人胚胎發(fā)育早期——囊胚（受精后5~7d）中未分化的細(xì)胞。囊胚含有約140個(gè)細(xì)胞，外表是一層扁平細(xì)胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持(zhīchí)組織如胎盤等。中心的腔稱囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)的細(xì)胞群，稱內(nèi)細(xì)胞群，這些未分化的細(xì)胞可進(jìn)一步分裂、分化，發(fā)育成個(gè)體。內(nèi)細(xì)胞群在形成內(nèi)、中、外三個(gè)胚層時(shí)開(kāi)始分化。每個(gè)胚層將分別分化形成人體的各種組織和器官。如外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等，中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織，內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等。由于內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成完整的個(gè)體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，稱為ESC。第十六頁(yè)，共二十三頁(yè)。第三節(jié)成體干細(xì)胞

越來(lái)越多的證據(jù)表明，ASC被移植入受體中能表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性。通常情況下，供體的干細(xì)胞在受體中分化為與其組織來(lái)源一致的細(xì)胞。而在某些情況下，干細(xì)胞的分化并不遵循這種規(guī)律。1999年，Goodell等分離出小鼠的肌肉(jīròu)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)后，與少量的骨髓間質(zhì)細(xì)胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細(xì)胞會(huì)分化為各種血細(xì)胞系，這種現(xiàn)象被稱為干細(xì)胞的橫向分化。以造血干細(xì)胞為例加以說(shuō)明。第十七頁(yè)，共二十三頁(yè)。造血干細(xì)胞(HSC)是體內(nèi)各種血細(xì)胞的唯一來(lái)源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。造血系統(tǒng)是體內(nèi)高度活躍和高度新陳代謝系統(tǒng)，HSC的基本特征是自我維持和自我更新，即通過(guò)不對(duì)稱性有絲分裂，在不斷產(chǎn)生大量祖細(xì)胞的同時(shí)，使自己不增殖也不分化。由HSC到祖細(xì)胞再到外周血細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，依賴于各種造血生長(zhǎng)因子、造血基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等多種因素的相互作用與平衡，并涉及細(xì)胞的增殖分化、發(fā)育成熟、遷移(qiānyí)定居、衰老凋亡和癌變等生命科學(xué)中的許多基本問(wèn)題，這也是基礎(chǔ)研究的主要熱點(diǎn)。第十八頁(yè)，共二十三頁(yè)。

1．造血干細(xì)胞的特點(diǎn)首先，在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，HSC歷經(jīng)多次遷移，先由卵黃囊轉(zhuǎn)移到胎肝，最后到達(dá)骨髓，其后的某些條件下又可出現(xiàn)(chūxiàn)髓外造血的情況；而其它多能干細(xì)胞多在固定的場(chǎng)所發(fā)育成特定的組織。

其次，由于生理需要，HSC始終處于較為活躍的增殖與分化狀態(tài)，能從骨髓源源不斷地進(jìn)入外周血而到達(dá)全身各處，而成熟個(gè)體中的多能干細(xì)胞多局限于相應(yīng)的組織器官中，一般情況下處于類似休眠的狀態(tài)。

第三，造血干細(xì)胞具有可塑性，可以分化為肝臟、肌肉及神經(jīng)等組織的細(xì)胞，一定條件下又可來(lái)源于肌肉干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等。第十九頁(yè)，共二十三頁(yè)。

2．骨髓庫(kù)在臨床治療中，HSC應(yīng)用較早，HSC移植就是應(yīng)用超大劑量化療和放療以最大限度殺滅患者(huànzhě)體內(nèi)的白血病細(xì)胞，同時(shí)全面催毀其免疫和造血功能，然后將正常人的HSC輸入患者體內(nèi)，重建造血和免疫功能，達(dá)到治療疾病的目的。但是，造血干細(xì)胞移植需先進(jìn)行人白細(xì)胞抗原（HLA）配型。HLA是人體細(xì)胞表面的“主要組織相容性復(fù)合物”，只有兩個(gè)個(gè)體HLA配型相同，才能進(jìn)行HSC移植，否則會(huì)發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)（GVHD）或移植排斥反應(yīng)，嚴(yán)重者可危及患者生命。第二十頁(yè)，共二十三頁(yè)。HLA由遺傳決定，理論(lǐlùn)上說(shuō)，每五個(gè)同胞兄弟姐妹中可能有2人的HLA抗原完全相合，而在無(wú)血緣關(guān)系的人群中，約10萬(wàn)人以上才可能有兩個(gè)HLA完全相同的個(gè)體。鑒于我國(guó)國(guó)情，在年輕患者的同胞中尋找HLA相合供體的可能性極小由于HSC具有自我復(fù)制功能，捐贈(zèng)骨髓一般不影響健康。現(xiàn)在可通過(guò)HSC“動(dòng)員”技術(shù)，采集分離約200毫升外周血而得到足夠數(shù)量的HSC，稱為外周血干細(xì)胞移