瓊脂稀釋法操作步驟

瓊脂稀釋法操作步驟目前一頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)原理：將抗菌藥物配制到瓊脂培養(yǎng)基中成：128ｕg/ml、64ｕg/ml、32ｕg/ml……0.06ｕg/ml對(duì)倍稀釋的濃度系列多點(diǎn)接種器將制備好的細(xì)菌菌懸液迅速點(diǎn)種到瓊脂表面,經(jīng)35℃16-20小時(shí)培養(yǎng)肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng),以未見細(xì)菌生長(zhǎng)平板的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)目前二頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)

抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備1估算抗菌藥物最小稱量瓊脂稀釋法最高藥物濃度為128ｕg/ml藥物和培養(yǎng)基的體積比1:14,即藥物濃度將成15倍稀釋，因此保存液為

128ｕg/mlΧ15=1920ｕg/ml如果1次用量為10ml,則:

抗菌藥物最小稱量=1920ug/ml*10ml抗菌藥物的效價(jià)目前三頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備2抗菌藥物稀釋選擇合適的抗菌藥物稀釋液進(jìn)行藥物稀釋,稀釋液需要量見下列公式：稀釋液體積=抗菌藥物實(shí)際稱量*效價(jià)保存液濃度（1920ug/ml）目前四頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)

抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備3實(shí)際操作：先計(jì)算完成一批試驗(yàn)需幾次完成,每次用量多少,然后可一起稱量,一起稀釋,然后按每次需要量分裝在試管中,貼上標(biāo)簽,注明藥物名稱,濃度,體積數(shù)及配制日期,置與≤-20℃保存,備用。目前五頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)培養(yǎng)基需氧菌MH肉湯或瓊脂苛氧菌嗜血桿菌屬：Haemophilustestmediumbase+補(bǔ)充因子SR158鏈球菌屬：MHA瓊脂+5%脫纖維羊血卡他莫拉菌屬：MHA瓊脂+5%脫纖維羊血淋球菌：CCAgarBase+L53厭氧菌Wilkinschalgrenanaerobe瓊脂目前六頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)菌液準(zhǔn)備1生長(zhǎng)法：無菌環(huán)取4-5個(gè)菌落大小形態(tài)一致的菌落頂部后接種于4-5mlMH肉湯內(nèi)35℃培養(yǎng)4-6小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，亦可過夜培養(yǎng),但不允許超過18小時(shí)用肉湯/生理鹽水校正至0.5麥?zhǔn)瞎軡舛?-2X108CFU/ml目前七頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)菌液準(zhǔn)備2直接菌落懸浮法：從孵育了18-24h新鮮培養(yǎng)物的平板上，用無菌環(huán)取單個(gè)菌落接種于無菌肉湯/生理鹽水內(nèi)校正至0.5麥?zhǔn)瞎軡舛?-2X108CFU/ml推薦用于苛氧菌和潛在的MRS目前八頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)菌液準(zhǔn)備3對(duì)絕大多數(shù)細(xì)菌來說,上述用生長(zhǎng)法或直接菌落懸浮法制備的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?應(yīng)該再用無菌肉湯或生理鹽水行1:10稀釋,此時(shí)菌液濃度為1-2*107CFU/ml,調(diào)整好的菌液應(yīng)該在制備后的15分鐘內(nèi)完成點(diǎn)種目前九頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)菌液準(zhǔn)備4如一次實(shí)驗(yàn)需完成50株或100株細(xì)菌,則細(xì)菌要編上工作序號(hào)1-50或1-100,并在結(jié)果記錄紙上要一一對(duì)應(yīng)寫上工作序號(hào)和菌種編號(hào)目前十頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)瓊脂稀釋法藥敏平板的制備1配制融化的MH瓊脂或適合其他苛氧菌、厭氧菌等特殊細(xì)菌的培養(yǎng)基,待冷卻到48-50℃，澆制藥物平板。取滅菌的90mm平板12只,用記號(hào)筆在平板底部作好“點(diǎn)種標(biāo)記”、“藥物名稱”、“藥物濃度”,濃度從0.06ｕg/ml……128ｕg/ml,每種濃度1只平板共12個(gè)濃度系列。目前十一頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)瓊脂稀釋法藥敏平板的制備2取11支無菌玻璃試管(13Χ100mm),每支試管標(biāo)記為：960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1.875,0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用無菌移液管加無菌稀釋液1.5ml目前十二頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)瓊脂稀釋法藥敏平板的制備3將保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml濃度的抗菌藥物保存液取出融化后,用無菌移液管吸取2.5ml加入到128ｕg/ml標(biāo)記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1.5ml加入到960標(biāo)記的試管內(nèi),混勻后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml標(biāo)記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml標(biāo)記的玻璃試管內(nèi);混勻后再吸取2.5ml依次類推,直至最后一個(gè)0.06ｕg/ml標(biāo)記的平皿內(nèi)加入1ml,則抗菌藥物稀釋完成目前十三頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)瓊脂稀釋法藥敏平板的制備4準(zhǔn)備2只無藥的平板,作點(diǎn)種前和點(diǎn)種后質(zhì)控對(duì)照所有藥物平板應(yīng)保持表面干燥,不可有肉眼可見的水珠(可在35℃孵箱內(nèi)倒置平板開蓋烘干15-20分鐘)目前十四頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)瓊脂稀釋法藥敏平板的制備5如果需使用的藥物平板為100Χ100mm的方平板,則每根玻璃管內(nèi)需加入2.5ml的抗菌藥物稀釋液；每次無菌吸管吸取的抗菌藥物量應(yīng)該為4.5ml每只方平板應(yīng)加入2ml抗菌藥物試液無菌吸管內(nèi)應(yīng)存留下2.5ml與下一個(gè)濃度的玻璃試管內(nèi)的2.5ml稀釋液進(jìn)行充分混勻藥敏培養(yǎng)基應(yīng)加入28ml目前十五頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)測(cè)試菌液的點(diǎn)種1

預(yù)先將點(diǎn)種針和點(diǎn)種板高壓滅菌,并在孵箱內(nèi)烘干（52孔、100孔、或21孔）將已調(diào)整好濁度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量加樣器將菌液依次加入菌液點(diǎn)種板小孔內(nèi),并作好與藥物平板相應(yīng)的點(diǎn)種標(biāo)記,一般每小孔內(nèi)應(yīng)加入菌液270ｕl。每批試驗(yàn)均須保留有質(zhì)控菌位置和無菌菌液位置用酒精棉球清潔多點(diǎn)接種器后，將點(diǎn)種針安裝在多點(diǎn)接種器架子上，再將加好菌液的點(diǎn)種板安置上多點(diǎn)接種器的點(diǎn)種板位置上目前十六頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)測(cè)試菌液的點(diǎn)種2開啟多點(diǎn)接種器進(jìn)行點(diǎn)種，因每一根點(diǎn)種針直徑約3mm,因此點(diǎn)種到藥物平板上每點(diǎn)的菌液量約為2ｕl，所以接種量為104CFU/點(diǎn)點(diǎn)種時(shí)應(yīng)先點(diǎn)種對(duì)照前的質(zhì)控平板，然后從最低藥物濃度開始點(diǎn)種依次點(diǎn)種到藥物濃度最高的平板目前十七頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)目前十八頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)目前十九頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)目前二十頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)藥物平板的孵育

上述接種好的平板應(yīng)在室溫下靜置至接種點(diǎn)上的菌液被瓊脂完全吸收，再將藥敏平皿倒置，于35℃孵育16-20小時(shí)如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，則需33-35℃，絕對(duì)不能超過35℃，孵育24小時(shí)，閱讀結(jié)果萬古霉素藥敏試驗(yàn)的腸球菌和葡萄球菌等需孵24小時(shí)后，閱讀結(jié)果淋病奈瑟球菌需在5%CO2空氣環(huán)境中孵育20-24小時(shí)，閱讀結(jié)果目前二十一頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)結(jié)果閱讀和判斷結(jié)果閱讀時(shí)，平板應(yīng)置于黑色不反光的表面上，記錄的MIC是完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度，單個(gè)菌落或接種物所致的輕微的不清晰現(xiàn)象可忽略不計(jì)。如果在MIC判斷終點(diǎn)附近持續(xù)存在或多個(gè)菌落，或者低濃度不長(zhǎng)，高濃度生長(zhǎng)；或者有俗稱的跳管現(xiàn)象，就應(yīng)該檢查試驗(yàn)菌的純度，有否污染菌生長(zhǎng)，并盡可能重復(fù)試驗(yàn)。按當(dāng)年的CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。目前二十二頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)質(zhì)控菌株

質(zhì)控菌株藥敏其他金黃色葡萄球菌ATCC29213+大腸埃希菌ATCC25922+大腸埃希菌ATCC35218+產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌ATCC700603+產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌ATCC27853+目前二十三頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)質(zhì)控菌株

質(zhì)控菌株藥敏其他肺炎鏈球菌ATCC49619糞腸球菌ATCC29212+檢測(cè)胸腺嘧啶流感嗜血桿菌ATCC49766+氨芐西林敏感株流感嗜血桿菌ATCC49247+產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶(-)氨芐西林耐藥株淋病柰瑟球菌：ATCC49226+厭氧菌ATCC25285+目前二十四頁\總數(shù)二十六頁\編于十四點(diǎn)常見問題及解決指南抗菌藥現(xiàn)象可能原因解決辦法氨基糖苷類