分子生物學在微生物檢驗中的應用

分子生物學在微生物檢驗中的應用第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五分子診斷學分子診斷學是以分子生物學理論為基礎，利用分子生物學的技術和方法研究人體內源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結構或表達調控的變化，為疾病的預防、預測、診斷、治療和轉歸提供信息和決策依據。第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五分子診斷學三個階段3個階段：（1）利用DNA分子雜交技術進行遺傳病的基因診斷；（2）以PCR技術為基礎的DNA診斷，特別是定量PCR和實時PCR的應用，不僅可以檢測存在于宿主的多種DNA和RNA病原體載量，還可檢測多基因遺傳病細胞中mRNA的表達量；（3）以生物芯片（biochip）技術為代表的高通量密集型檢測技術，生物芯片技術包括基因芯片，蛋白質芯片，組織芯片等。第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應過程,結合相應的軟件可以對結果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應的分析軟件。第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五熒光定量PCR標記方法內摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor(Intergen)第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標記探針（TaqmanProbe）第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五Taqman探針3′端Q熒光分子能夠吸收5′端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測不到5′端熒光分子發(fā)出的熒光,只能檢測到3′端熒光分子的熒光信號,但當溶液中有PCR產物(模板)時,探針與模板退火,即產生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而激活Taq酶的5′外切酶活性,將探針5′端連接的R熒光分子從探針上切割下來,破壞了兩個熒光分子間的FRET,從而發(fā)出熒光,切割的R熒光分子數與PCR產物的數量成比例,因此,根據PCR反應液的熒光強度即可計算出初始模板的數量熒光能量傳遞技術(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標（MolecularBeaconProbe）第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五引物特異性探針（AmplisenorProbe）第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（AmplifluorProbe）第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五熒光定量實時PCR與普通PCR的比較實時在線監(jiān)控對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控,能夠實時地觀察到產物的增加,直觀地看到反應的對數期降低反應的非特異性使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合,提高了PCR反應的特異性增加定量的精確性全程監(jiān)控,準確的算法進行定量結果分析更加快捷方便,無需跑膠

第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五基因和蛋白質芯片原理基因芯片(genechip)也稱為DNA微距陣(DNAmicroarray)、DNA芯片(DNAchip)等。它是指將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地高密度地排列固定于玻片、硅片等固相載體上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基互補配對原理進行雜交，通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，再經計算機軟件處理，從而獲取大量的信息。第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五基因微陣列技術優(yōu)勢基因微陣列技術作為一種高通量的檢測新技術,可以同時檢測數以萬計的生物分子，現在已經廣泛應用于各個方面，其中包括病原生物的監(jiān)控和診斷。發(fā)現未知病原體。例如確定SARS-CoV應用了基因微陣列技術。第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五目前國內外蛋白質芯片或基因芯片產品的進展情況

國外:賽弗吉生物系統(tǒng)公司（納斯達克代碼：CIPH）的蛋白質芯片系統(tǒng)已經通過了中國國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）的醫(yī)療設備審批。這也是廣譜儀器第一次在中國被批準作為一種醫(yī)療設備使用。affymetrix公司開發(fā)出測P53基因是否有突變以判斷患癌癥可能性的P53芯片，能診斷藥物代謝缺乏癥的細胞色素P450芯片.在病原體的檢測方面,成功的例子有HBV、丙型肝炎病毒HCV、甲型肝炎病毒（HAV）、庚型肝炎病毒（HGV）、巨細胞病毒（CMV）、梅毒、弓形蟲、結核桿菌等多種病原體的診斷基因芯片.另外血液RD等25種紅細胞抗體系統(tǒng)以及高血壓病因,血管內皮細胞生長因子（VEGF）和人促黃體生成激素（hLH）等也都有了診斷基因芯片。在腫瘤方面,蛋白質芯片已成功地應用于診斷白血病、乳腺癌、心力衰竭等疾病的診斷,診斷用的抗體芯片有霍亂毒素、葡萄球菌內毒素B、蓖麻蛋白和枯草桿菌球體的診斷.最近，siemens公司、fraunhofer硅工藝研究院和infineon公司正在開發(fā)電化學生物芯片診斷系統(tǒng).第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五國內:上海數康生物科技有限公司研制開發(fā)的“多腫瘤標志物蛋白質芯片診斷系統(tǒng)”于2001年12月獲得國家衛(wèi)生行政部門頒發(fā)的新藥證書和試生產批文。本實驗室采用該診斷系統(tǒng)對12種腫瘤標志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖原199(CA199)、糖原242(CA242)、糖原(CA125)、糖原153(CA153)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、前列腺特異抗原(PSA)、游離前列腺特異抗原(f-PSA)、鐵蛋白(FER)、β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)，人生長激素(HGH)含量進行定量分析,測定9種腫瘤(如卵巢腫瘤,肝癌等).第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五由上海裕隆生物科技有限公司及曲阜裕隆生物科技有限公司研發(fā)丙型肝炎病毒分片段抗體檢測試劑盒（蛋白芯片）能夠同時檢測血清或血漿中抗HCVCore、抗HCVNS3、抗HCVNS4、抗HCVNS5以及上述四種抗體的總抗體5項指標，突破了傳統(tǒng)的丙型肝炎酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測試劑盒一次只能檢測初篩指標抗HCV總的局限，而采血量僅為ELISA法的1/5，具有丙型肝炎感染初篩和確診的雙重功能，并能反映丙型肝炎感染、治療和愈后狀況。此外，該試劑盒還具有檢測特異性強、靈敏度高、平行性好、成本低、操作簡單快速、自動化程度高等優(yōu)點。2004年6月24日獲國家食品藥品監(jiān)管局頒發(fā)的新藥證書。這標志著我國生物芯片技術向臨床免疫檢測領域的又一次成功突破。瑞芯生物科技有限公司已成功開發(fā)出乙型肝炎基因多態(tài)性檢測芯片、丙型肝炎基因分型檢測芯片、結核分支桿菌耐藥性檢測芯片、地中海貧血癥檢測芯片等產品.第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五建立基因芯片技術平臺探針設計探針制備探針點片樣本處理雜交條件標記方法結果分析平行比較第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五等溫擴增技術RCA(RollingCircleAmplification)LAMP(loop-mediatedisothermalamplification)NASBA((Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五未知病原體檢測新技術高通量測序DNA再（重）測序芯片多重PCR和質譜聯用第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五未知病原體檢測-----高通量測序IROCHE購買了454GS2.0，GSFLX454生命科學公司在測序過程中采用了納米材料，使測序速度提高了100倍。該生命科學公司利用皮升（picolitre）級反應器進行測序，雖然這種新的測序方法單個反應的讀取堿基數和準確率都不及毛細管電泳法，但是由于一次反應數量巨大，所以總體上取得了高速的突破。150-200bp(GS2.0),0.1GB300-500bp(GSFLX)1GB每小時600Mbp(100倍Sanger法)一個人一臺機器100天內輕松地完成30億bp(3G)第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五ILLUMINA買了SOLEXA;Solexa技術:IlluminaGenomeAnalyzer測序儀基本原理：可逆性末端終結反應四種堿基分別標記四種不同熒光，每個堿基末端被保護基團封閉，單次反應只能加入一個堿基，經過掃描，讀取該次反應顏色后，該保護基團被除去，下一個反應可繼續(xù)進行，如此反復，得出堿基的精確序列17～35bp的序列1GB第二十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期五ABI買了AGENCOURTSolid系統(tǒng)寡核苷酸連接和檢測原理60bp4GB第二