T-DALN 029-2023 生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測

ICS65.020.30CCSB40團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/DALN029-2023生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測StaphyiococcusQuantitativetestinginFreshmilk?2023-05-04發(fā)布 2023-05-19實(shí)施遼寧省奶業(yè)協(xié)會(huì)協(xié)會(huì)發(fā)布T/DALN029-2023T/DALN029-2023前??言本文件參照GB/T1.1-2020《 化工作導(dǎo)則第1部分： 化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則給出的規(guī)則起草。本起草單位：遼寧省奶業(yè)協(xié)會(huì)、遼寧奉牧聯(lián)合奶業(yè)有限公司、沈陽師范大學(xué)食品學(xué)本主要起草人：佟艷、李潤國、朱旻鵬、楊明潔、賈麗嬌、王南南、白春生、唐瑩、高忠梅、白子金、高林、杜宏偉、鄭曉明、王長霞本由遼寧省奶業(yè)協(xié)會(huì)提出并歸口。本版權(quán)歸遼寧省奶業(yè)協(xié)會(huì)。本首次發(fā)布。生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測范圍本 規(guī)定了生鮮乳中金黃色葡萄球菌定量檢測的術(shù)語與定義及儀器設(shè)備和試劑鑒定金黃色葡萄球菌引物與探針說明、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判定、人員防護(hù)、注意事項(xiàng)等。本適用于生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范NY/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法YY/T1173聚合酶鏈反應(yīng)分析儀JJF1527聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語及定義適合于本文件金黃色葡萄球菌 Staphyiococcus實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) QuantitativeReal-timePCR）PCR（QuantitativeReal-timePCR）DNADNA引物PrimerDNAPCR模板TempiateDNAPCRYY/T1173JJF1527-201儀器設(shè)備和試劑儀器和設(shè)備滅菌處理器具:1.5mLPCRTipPCR微量離心機(jī)可調(diào)微量移液器（10μL～1000μL）微量蛋白-核酸檢測儀試劑除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑,水為滅菌雙蒸水。DNAAceQUniversalUProbeMasterMixV2。5擴(kuò)增基因金黃色葡萄球EbpS基因（GenBank:U48826.2）。引物使用說明引物EbpS-F、EbpS-R、EbpS-Probe在使用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋成濃度為10umol/L。探針說明EbpSTaqMan5’端標(biāo)記為：6-FAM（6-羧基熒光素）；3’端標(biāo)記為：BHQ1（）。目的片段預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段134bp。質(zhì)控質(zhì)粒EbpS-pMD-19-T-DH5αLB20mLLB180rpm/min12h5mLEbpS實(shí)驗(yàn)方法樣品準(zhǔn)備模板制備按照基因組DNA提取試劑盒的說明書提取各乳樣DNA。檢驗(yàn)步驟PCR30min，根據(jù)檢測數(shù)量和孔反應(yīng)，設(shè)置熒光收集反應(yīng)孔數(shù)和反應(yīng)參數(shù)，反應(yīng)程序和條件如下表所示：表1PCR反應(yīng)程序要求PCR反應(yīng)程序反應(yīng)溫度反應(yīng)循環(huán)污染消化21個(gè)循環(huán)預(yù)變性51個(gè)循環(huán)95℃1045個(gè)循環(huán)60℃3045個(gè)循環(huán)8EbpS10DNA3表2PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系反應(yīng)組分添加量（μL）AceQUniversalU+Probe10F、R(10μM)0.4TaqManProbe(10μM)0.2模板2無酶水25μLPCRPCRCtCty=-3.3141x+44.364（yCtDNA。數(shù)據(jù)處理，根據(jù)曲線，計(jì)算每個(gè)反應(yīng)孔中檢測核酸濃度。結(jié)果判定根據(jù)曲線計(jì)算孔中檢測核酸濃度，當(dāng)孔內(nèi)DNA濃度超過9.6ng/μL時(shí)，判定檢測9.56×104CFU/mL；當(dāng)孔內(nèi)DNA9.6ng/